IIIIIIIIIIIIIIIIII
I
MARKS & CLERK
Intellectual Property
*18-11-02-923308*
Conseils en propnete mausineite
European Patent Attorneys
Established 1887
Ministère des Affaires Economiques
Administration de la Politique commerciale
OFFICE DE LA PROPRIETE INDUSTRIELLE
North Gate III
boulevard du Roi Albert II 16
B-1000 BRUXELLES
Please quote
Our reference:
Luxemoourg um ce
6 Rue Glesener
Luxembourg
Tel: (+352) 40 02 70
Fax: (+352) 40 04 96
E-mail: admin@marksclerk.lu
http:/Avww.marks-clerk. com
Postal address:
BP 1775
L-1017 Luxembourg
02044-4
Your reference:
Date: 13 novembre 2002
- RECOMMANDEE -
Concerne: Dépôt d'une traduction
Demande de brevet européen 97923643.7 (EP 0923308)
au nom de GENZYME TRANSGENICS CORPORATION
Date de délivrance: 18.09.02
Messieurs,
Ü330S
INFORMATIQUE
21.-11-2002
Conformément à l'article 65 de la Convention de Munich, nous vous remettons en
annexe un exemplaire de la traduction française de la demande sous rubrique désignant la
Belgique.
Le document de délégation de pouvoir est joint à la présente.
Nous vous remercions d'avance de bien vouloir nous accuser réception de ce
document.
Veuillez agréer, Messieurs, l'expression de nos sentiments les meilleurs.
qpri ?? pit!
|18.-11-2QC2; ;
i?
ENTRÉE
INGEKOtvîCH-'ï-V.
i i
Annexes:
1 exemplaire de la traduction française
1 pouvoir
1 copie de la Décision de délivrance (OEB form. 2006)
J.J.Pierre WEYLAND
mandataire
(matricule Ql 01)
London Birmingham Glasgow Manchester Oxford Cheltenham Leeds Alicante Munich Luxembourg Hong Kong Ottawa TorontoBELGIUM
POUVOIR
AUTHORISATION
Les soussignés
The undersigned
Genzyme Transgenics Corporation
constituent pour mandataire et donnent pouvoir à hereby constitute and appoint
J.J.Pierre WEYLAND
HARKS & CLERK
6, rue Glesener
BP 1775
L-1017 Luxembourg
à les représenter devant l'Office belge de la
Propriété Industrielle dans toutes procédures
relatives au brevet/à la demande de brevet
to represent them in all proceedings before the
Belgian Industrial Property Office relating to
patent/patent application
97923643.7
d'accomplir toutes formalités requises en Belgique
pour le maintien en vigucur/ia défense du brevet/de
la demande de brevet précité/e. En conséquence
ledit mandataire est autorisé à signer et déposer
toutes pièces, à verser et retirer toutes taxes et à
faire en général tout ce qui sera nécessaire et utile à
la bonne exécution des procédures précitées.
to fulfil all formal requirements in Belgium for the
maintenance/defence of the above patent/patent
application. In the execution of this authorisation,
the above representative is hereby authorised to
sign and file all documents, to pay and withdraw all
taxes and to do generally all that may be necessary
or useful to complete the proceedings referred to
above.
Faità Framingham, MA / ÜS
Signed at
the
21/03/02
Signature
?^az^Au.
Nom John B. Green
Name
Titre Vice President
Title
(no legalisation)ê
£3" EPA/EPO/OEB
D-80298 München
"E + 49 89 2399-0
TX 523 656 epmu d
FAX +49 89 2399-4465
Europäisches
Patentamt
Genera ld I rekt ion 2 _
European
Patent Office
Directorate General 2
Office européen
des brevets
______Direction Génerale 2
r
i_
Ruffles, Graham Keith
MARKS & CLERK,
57-60 Lincoln's Inn Fields
London WC2A 3LS
GRANDE BRETAGNE
Ü.'
? ,-(«_
l2 jfl/'f ir.««
j i [-"O^V-V;.
~i
._J
' | Datum/Date
08/08/02
Zeichen/RefVRéf.
799P79208
Anmeldung Nr^Application No./D8mande n'JPateni Nr ./Patent No-ZBrevet n"
97923643.7-1221 0923308
Anmelder/Applicant/Dâmandeur/PatentlnnabeirProprietor/Tltulaire
GENZYME TRANSGENICS CORPORATION
DECISION TO GRANT A EUROPEAN PATENT PURSUANT TO ARTICLE 97(2) EPC
Following examination of European patent application No. 97923643.7
a European patent with the title and the supporting documents indi-
cated in the communication pursuant to Rule 51(4) EPC dated 11.05.01
is hereby granted in respect of the designated Contracting States.
Any modifications which were subsequently requested have been approved
by the Examining Division. Any corrections requested by the applicant
after receipt of the communication under Rule 51(6) and received at
the EPO on 00.00.00 have been taken into account.
Patent No.
Date of filing
Priority claimed
Designated Contracting States
and Proprietor(s)
0923308
13.05.97
13.05.96/US 648235
: AT-BE-CH-DE-DK-ES-FI-FR-GB-GR-IE-IT-LI
LU-MC-NL-PT-SE
GENZYME TRANSGENICS CORPORATION
One Mountain Road
Framingham, MA 01701/US
This decision will take effect on the date on which the European
Patent Bulletin mentions the grant (Art. 97(4) and (5) EPC).
The mention of the grant will be published in European Patent
Bulletin 02/38 of 18.09.02.
Examining Division
LEPRETRE F G M
DESMEDT G R A
DE JONG E C
EPO Form 2006 01.95
Registered letter
7051001 to EPO postal service: 02/08/02(11) No. de publication européen : 0923308
(12) Traduction du brevet européen Bl
(21) No. de dépôt de la demande
de brevet européen : 97923643.7
(22) Date de dépôt de la demande
de brevet européen : 13.05.97
(54) Titre : PURIFICATION DE PEPTIDES DE LAIT, ACTIFS DU POINT DE VUE
BIOLOGIQUE
(73) Titulaire(s) du brevet : GENZYME TRANSGENICS CORPORATION
One Mountain Road
Framingham MA 01701/US- i - EP 0923308
10 Cette invention concerne d'une manière générale un procédé amélioré pour purifier des
composants intéressants du lait. Plus précisément, elle propose un procédé pour obtenir des peptides à partir
de lait entier cru, sans traitement préalable pour enlever les matières grasses, les lipides ou les matières
particulaires, par utilisation d'une filtration tangentielle, de préférence à travers un système d'extraction
continue en boucle fermée.
15 Le lait des animaux domestiques est utilisé comme source de protéines et d'autres produits pour les
industries alimentaires et pharmaceutiques depuis de nombreuses années, et toutes sortes de techniques sont
connues pour isoler ces produits. Le lait est une suspension colloïdale composée essentiellement de matières
grasses, de lactose et de protéines dans de l'eau. Chez les ruminants et les animaux de laboratoire, le lait
contient en moyenne 30 à 140 grammes de protéine par litre, soit environ 4-17% en poids, selon l'espèce.
20 Ces protéines sont en majorité des caséines, qui sont complexées avec du calcium et du phosphate dans des
structures supramoléculaires connues sous le nom de micelles. L'autre catégorie majeure de protéines du lait
est celle des protéines de lactosérum, essentiellement composées de béta-lactoglobuline et d'alpha-
lactoglobuline, mais comprenant également de 'la lactoferrine, des immunoglobulines, et de l'albumine
sérique.
25 Les protéines du lait sont habituellement isolées par une combinaison de procédés. Le lait cru est
d'abord fractionné pour enlever les matières grasses, par exemple par écrémage, centrifugation,
sédimentation (H.E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied
Science Publishers, NY, 1982), précipitation à l'acide (brevet US n° 4644056) ou coagulation enzymatique
avec la rennine ou la chymotrypsine (Swaisgood, ci-dessus). Ensuite, les protéines majeures du lait peuvent
30 être fractionnées soit en une solution limpide soit en un précipité en masse à partir desquels la protéine
spécifique présentant un intérêt peut être facilement purifiée.
Même les améliorations récentes apportées à l'isolement des protéines de lait nécessitent une
première opération pour enlever les matières grasses et les lipides, suivie par une filtration pour récupérer
les composants ayant approximativement la taille de la protéine intéressante. Par exemple, le brevet US n°
35 2487642 décrit l'isolement de protéines de lait à partir de lait écrémé ou de lactosérum par une ultrafiltration
sur membrane combinée avec une Chromatographie d'exclusion ou une Chromatographie d'échange d'ions.
Le lactosérum est produit d'abord en éliminant la caséine par coagulation avec de la présure ou de l'acide
lactique. Le brevet US n° 4485040 décrit l'isolement d'un produit enrichi en alpha-lactoglobuline dans le- 2 - ? ? EP 0923308
rétentat à partir de lactosérum par deux étapes successives d'ultrafiltration. Le brevet US n° 4644056
propose une méthode pour purifier une immunoglobuline à partir de lait ou de colostrum par précipitation à
l'acide à pH 4,0-5,5, et filtration tangentielle séquentielle d'abord sur une membrane avec une taille dé pore
de 0,1-1,2 micromètres pour clarifier le stock de produit puis sur une membrane avec une limite de
5 séparation de 5-80 kD pour le concentrer.
De façon similaire, le brevet US n° 4897465 enseigne la concentration d'une protéine, telle qu'une
immunoglobuline, et son enrichissement, à partir de sérum sanguin, de jaunes d'?ufs ou de lactosérum par
ultrafiltration séquentielle sur des membranes d'oxyde métallique avec un décalage de pH. La filtration est
d'abord effectuée à un pH en dessous du point isoélectrique (pi) de la protéine choisie pour enlever la
10 plupart des contaminants du rétentat protéique, et ensuite à un pH au dessus du pi de la protéine choisie
pour retenir les impuretés et faire passer la protéine choisie dans le perméat. Une méthode de concentration
par filtration différente est enseignée par le brevet européen n° EP 467482 B 1 dans laquelle du lait écrémé
dégraissé est réduit à pH 3-4, en dessous du pi des protéines de lait, pour solubiliser à la fois la caséine et
les protéines de lactosérum. Trois tours successifs d'ultrafiltration ou de diafiltration concentrent ensuite les
15 protéines pour former un rétentat contenant 15-20% de solides dont 90% sont des protéines. En variante, la
demande de brevet britannique n° 2179947 décrit l'isolement de lactoferrine à partir de lactosérum par
ultrafiltration pour concentrer l'échantillon, suivie par une Chromatographie d'échange de cations faibles
approximativement à un pH neutre. Aucune mesure de pureté n'est mentionnée. Dans la publication PCT n°
WO 95/22258, une protéine telle que la lactoferrine est récupérée à partir d'un lait qui a été ajusté à une
20 force ionique élevée par l'addition de sel concentré, suivie par une Chromatographie d'échange de cations.
Dans toutes ces méthodes, le lait ou une de ses fractions est d'abord traité pour enlever les matières
grasses, les lipides, et d'autres matières particulaires qui encrasseraient les membranes de filtration ou les
milieux de chromatographic Les fractions initiales ainsi produites peuvent se composer de caséine, de
lactosérum, ou de protéines totales de lait, à partir desquelles la protéine intéressante est ensuite isolée.
25 Cependant, ces techniques présentent des inconvénients importants, notamment la nécessité de
centrifugeuses continues et/ou discontinues de grande taille et coûteuses, des faibles rendements dus à la
perte de protéine par emprisonnement au cours de la précipitation, et une perte d'activité biologique de la
protéine intéressante par les méthodes de précipitation nécessitant un faible pH. Ces limitations peuvent être
tolérées pour des protéines relativement bon marché présentes en très grandes quantités et utilisées comme
30 produits de base dans les denrées alimentaires, par exemple dans la production de fromage. Par contre, elles
constituent un frein économique significatif si la protéine représente une petite fraction des protéines totales
du lait, représente un composé pharmaceutique onéreux, ou se compose d'une enzyme ou d'une autre
protéine thérapeutiquement active qui doit absolument conserver son activité biologique.
L'ensemble de ces conditions s'obtiendrait, par exemple, dans la purification d'une protéine
35 pharmaceutique à partir du lait d'animaux transgéniques. Les niveaux d'expression des protéines exogènes
vont généralement de moins de 1 à 10 ou plus grammes par litre, selon la protéine et l'espèce. Dans un
produit avec une valeur marchande annuelle potentielle de, par exemple, 100 mutions de $, chaque perte de
1% représente 1 million de $.
Des méthodes sont connues dans la technique pour exprimer des protéines exogènes à des niveaux
40 commercialement réalisables dans le lait d'animaux transgéniques. La production commerciale d'un large-3- EP 0923308
éventail de protéines dans le lait de bétail transgénique est maintenant en cours de mise au point (AJ. Clark
et al., Trends in Biotechnology, 5: 20-24, 1987, A.J. Clark, Journal of Cellular Biochemistry, 49: 121-127,
1992; W. Bawden et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 12: 89-137, 1994; N.S. Rudolph,
Genetic Engineering News, 15: 8-9, 1995). Des peptides exogènes, et en particulier des peptides humains,
5 peuvent être produits dans le lait à des concentrations relativement élevées et dans des gros volumes,
assurant un niveau de production élevé continu de peptides normalement remaniés qui sont facilement
récupérés à partir d'une ressource renouvelable. La purification de ces précieuses protéines par des procédés
classiques est sujette aux pertes de rendement et d'activité décrites ci-dessus. Par exemple, A.J. Clark et al.
ont mentionné un taux de récupération du facteur anti-hémophilique B d'environ 2,0-2,5% par précipitation
10 à l'acide de la caséine du lait obtenu à partir de brebis transgéniques, pour une perte d'environ 98% (A.J.
Clark et al., Biotechnology 7: 487-492, 1989). J. Denman et al. ont mentionné un taux de récupération d'une
variante à longue durée d'action de l'activateur tissulaire du plasminogène d'environ 25%, soit une perte de
75%, par précipitation à l'acide de caséines du lait issu de chèvres transgéniques (J. Denman eî al.,
Biotechnology 9: 839-843, 1991).
15 La publication de brevet PCT n° WO 94/19935 décrit un procédé d'isolement d'une protéine
biologiquement active à partir de lait entier par stabilisation de la solubilité des protéines de lait totales avec
un agent chargé positivement tel que l'arginine, rimidazole ou le Bis-Tris. Ce traitement forme une solution
clarifiée à partir de laquelle la protéine peut être isolée, par exemple par filtration sur des membranes qui
sinon seraient colmatées par les protéines précipitées. La concentration de l'additif est élevée, de l'ordre de
20 1-3 molaire. Dans certains cas, U peut être préférable de minimiser les grandes quantités requises d'agents
particulièrement coûteux, tels que l'arginine, qui dans tous les cas doivent être enlevés dans les étapes de
purification ultérieures. Ce procédé demande également une première étape de centrifugation pour enlever
la matière grasse du lait. Ce que l'on décrit ici est une amélioration par rapport à des méthodes connues dans
la technique pour isoler des composants solubles de lait, La présente invention réduit les pertes de
25 rendement en proposant des conditions douces qui préservent l'activité biologique dans un procédé efficace
et rentable convenant à une production à grande échelle.
Le brevet US 5028436 décrit un procédé pour séparer le lait en constituants dissous et non dissous
par passage à travers une membrane microporeuse prétraitée avec des lipides et/ou des peptides.
RESUME DE L'INVENTION
30 La présente invention propose un procédé pour isoler un composant exogène soluble, tel qu'un
peptide, sous sa forme biologiquement active, à partir de lait entier ou d'une fraction de lait par filtration
tangentielle. A la différence des méthodes d'isolement antérieures, le procédé de cette invention supprime la
nécessité d'un premier fractionnement du lait entier pour enlever la matière grasse et les micelles de caséine,
simplifiant ainsi le procédé et évitant des pertes coûteuses de récupération et de bioactivité. Ce procédé peut
35 être utilisé en combinaison avec des étapes de purification supplémentaires pour enlever encore des
contaminants et purifier le composant intéressant.
Selon l'invention, le lait entier est soumis à une filtration tangentielle sur une membrane
d'ultrafiltration de porosité suffisante pour former un perméat (filtrat) comprenant un composant exogène
soluble et un rétentat contenant la matière grasse, d'autres substances colloïdales, des particules, des virus,- 4 - EP 0923308
des mycoplasmes, des bactéries et des cellules somatiques. Le perméat est soumis à une procédure de
capture pour enlever substantiellement le composant exogène soluble, et l'effluent de cette procédure de
capture (par exemple une procédure de capture autre qu'une filtration tangentielle) est combiné avec le
rétentat. Cette procédure est répétée ou continuée jusqu'à ce que le composant exogène soluble soit
5 substantiellement récupéré, la récupération du composant exogène étant de 75-95%.
La ou les procédures de capture (par exemple, une procédure de capture autre qu'une filtration
tangentielle) servent à éliminer les contaminants éventuels qui peuvent être présents, fournissant ainsi une
préparation purifiée du composant intéressant. Ces procédures supplémentaires peuvent comprendre une
ultrafiltration, une Chromatographie d'affinité, une Chromatographie d'échange d'ions, une Chromatographie
10 hydrophobe, une Chromatographie en phase inverse, ou d'autres types de Chromatographie de capture qui
sont bien connus de l'homme de l'art
Eventuellement, cette procédure est réalisée sous la forme d'un système d'extraction continue en
boucle fermée, dans lequel le perméat est conduit directement jusqu'au dispositif de capture, et l'éluat issu
de la procédure de capture est renvoyé directement dans le rétentat
15 Eventuellement, le lait entier est d'abord combiné avec un agent chélatant tel que l'acide
émylènediaminetétraacétique (EDTA) qui, curieusement, empêche de lait de former des grumeaux et
améliore l'écoulement du perméat à travers le filtre d'ultrafiltration. Cette combinaison de lait et d'agent
chélatant est soumise directement à une filtration tangentielle comme décrit ci-dessus, sans traitement
supplémentaire.
20 Dans un autre aspect de l'invention, la procédure est réalisée sous la forme d'un système
d'extraction continue en boucle fermée dans lequel le lait entier est soumis à une filtration tangentielle sur
une membrane d'ultrafiltration de porosité suffisante pour former un perméat (filtrat) comprenant un
composant exogène soluble et un rétentat contenant la matière grasse, d'autres substances colloïdales, des
particules, des virus, des mycoplasmes, des bactéries et des cellules somatiques. Le perméat est ensuite
25 conduit jusqu'au dispositif de capture (le dispositif de capture étant autre chose qu'une filtration
tangentielle), par exemple une dispositif de Chromatographie de capture, par exemple un dispositif de
Chromatographie d'échange d'ions ou un dispositif de Chromatographie d'affinité, par exemple une colonne
d'affinité sur héparine, une colonne d'affinité sur Protéine A ou une colonne d'affinité sur Protéine G, et
l'éluat issu de la procédure de capture est renvoyé dans l'échantillon de lait initial (rétentat). Cette procédure
30 est continuée jusqu'à ce que le composant exogène soluble soit substantiellement récupéré.
Par conséquent, c'est un objectif de la présente invention de proposer un procédé efficace pour
isoler un composant exogène soluble à partir de lait entier ou d'une de ses fractions par filtration tangentielle
sur une membrane d'ultrafiltration.
C'est un autre objectif de la présente invention d'éliminer le besoin de traiter d'abord le lait entier
35 avant filtration pour enlever les matières grasses, les micelles de caséine, les lipides et les particules qui
pourraient sinon encrasser le filtre microporeux. C'est un objectif supplémentaire de la présente invention de
proposer un procédé qui élimine spécifiquement le besoin de traiter d'abord le lait entier par des étapes
telles qu'une précipitation ou une centrifugation, qui emprisonnent une partie du composant exogène soluble
et réduisent son rendement.- 5 -??-?? EP 0923308
C'est un objectif supplémentaire de la présente invention de proposer un procédé qui utilise des
conditions douces, évitant en particulier les solvants organiques et les extrêmes de pH et de température,
préservant ainsi l'activité biologique du composant soluble du lait.
C'est un objectif supplémentaire de la présente invention de proposer un procédé d'extraction
5 continue en boucle fermée qui maintient un volume constant sans dilution ou expansion volumique, ce qui
rend le procédé efficace et rentable pour une purification à grande échelle.
C'est un objectif supplémentaire de la présente invention de fournir un perméat de filtration
tangentielle qui peut être soumis à des étapes de purification supplémentaires pour enlever des contaminants
et donner ainsi un composant exogène soluble purifié, une ou plusieurs desdites étapes pouvant être incluses
10 dans le système d'extraction continue en boucle fermée.
C'est un objectif supplémentaire de la présente invention de proposer un procédé qui combine en
un seul procédé séquentiel une filtration tangentielle et une procédure de capture pour séparer un composant
exogène soluble.
C'est un objectif supplémentaire de la présente invention de proposer un procédé d'addition d'un
15 agent chélatant tel que l'EDTA pour améliorer le passage à travers la membrane d'ultrafiltration et pour
contribuer à réduire la prise en masse du lait et l'encrassement de la membrane pendant le processus de
filtration.
C'est un objectif supplémentaire de la présente invention de proposer un procédé dans lequel les
milieux d'ultrafiltration et de Chromatographie sont choisis parmi les milieux qui peuvent être nettoyés et
20 réutilisés de multiples fois sans changement substantiel de la performance. La réutilisation de milieux
coûteux réduira sensiblement le coût global de la purification.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 est une représentation schématique d'un exemple d'appareil utilisé pour la purification
de peptides biologiquement actifs à partir de lait dans un système d'extraction continue en boucle fermée
25 incluant une filtration tangentielle et une Chromatographie d'affinité sur héparine.
La figure 2 est supprimée.
Les figures 3A et 3B illustrent l'effet de l'EDTA à différentes valeurs de pH sur la filtrabilité du lait
entier.
La figure 4 illustre un électrophorégramme d'un gel de Polyacrylamide-SDS coloré à l'argent
30 montrant l'effet de différents agents chélatants sur la pureté d'antithrombine isolée à partir de lait.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention propose un procédé pour isoler à partir de lait un composant soluble du lait
sous sa forme biologiquement active. De préférence, le lait est du lait entier. Le composant soluble du lait
est un composant exogène qui est introduit par transfert de gène dans un animal transgénique ou
35 transomique.
Ce composant soluble du lait peut être un peptide et, en particulier, une protéine. La protéine peut
être, par exemple, une glycoprotéine, une immunoglobuline, une enzyme, un peptide ou une hormone. Il- 6 - EP 0923308
peut s'agir d'une protéine naturelle ou d'une protéine recombinante. Elle peut être d'origine humaine ou non
humaine. Il peut s'agir d'un agent thérapeutique ou pharmaceutique potentiel tel que, mais sans y être limité:
rérythropoïétine, l'inhibiteur de l'alpha-1 proteinase, la phosphatase alcaline, l'angiogénine, l'antithrombine
IU, n'importe lequel des facteurs de coagulation du sang y compris le facteur VIII, le facteur LX, et le
5 facteur X, la chitinase, la superoxyde dismutase extracellulaire, le fibrinogène; la glucocérébrosidase, la
glutamate decarboxylase, la serumalbumine humaine, les immunoglobulines, l'insuline, la protéine basique
de la myéline, la proinsuline, le CD4 soluble ou un composant ou complexe de celui-ci, la lactoferrine, la
lactoglobuline, le lysozyme, la lactalbumine, l'activateur tissulaire du plasminogène ou un de leurs variants.
En variante, le composant du lait peut être utilisé comme ingrédient pour produits alimentaires, par
10 exemple pour augmenter la valeur nutritionnelle du pain (brevet US n° 5178894) ou d'un aliment infantile
(publication PCT n° WO 91/08216), ou pour ajouter du corps, une texture ou une stabilité aux produits
laitiers tels que les desserts laitiers congelés (brevet US n° 5175013). Il peut également être utilisé comme
additif pour la culture sans sérum de certains types de cellules, tels que les cellules epitheliales ou les
fibroblastes (K.S. Steimer et al., J. Cell Physiol. 109: 223-234, 1981; K.S. Steimer et M. Klagsbrun, J. Cell
15 Biol. 88: 294-300, 1981). De plus, il peut s'agir d'une enzyme industrielle telle qu'une protease, une lipase
ou une chitinase (publication PCT n° WO 93/25567).
Le lait peut être recueilli auprès d'un mammifère en lactation tel qu'une vache, chèvre, truie, lapine,
souris, rate ou brebis. Le mammifère peut être un animal transgénique ou transomique. Comme on l'utilise
ici, un animal transgénique ou transomique doit désigner un animal non humain. Un animal transgénique est
20 généralement défini comme un animal qui exprime un peptide ou un autre caractère d'une espèce différente
par suite de l'incorporation stable d'un ou plusieurs gènes étrangers dans son génome. Un tel peptide est
désigné sous le nom de peptide exogène. La sécrétion des peptides exogènes dans le lait d'animaux
transgéniques est accomplie au moyen de méthodes connues dans la technique pour introduire dans un ceuf
fertilisé ou un embryon une construction génique de fusion ou recombinante qui comprend des séquences
25 codant pour la protéine plus des séquences régulatrices d'une protéine spécifique du lait telle que la caséine,
la protéine acide du lactosérum ou la lactoglobuline. Ces constructions de fusion peuvent diriger
l'expression d'une protéine exogène essentiellement ou exclusivement dans le lait, en concentrations
suffisamment élevées pour rendre son isolement commercialement possible.
Le lait peut également être recueilli auprès d'un animal transomique, également nommé animal
30 transomatique, qui est un animal qui exprime une protéine ou un caractère d'une autre espèce par suite de
l'introduction d'un ou plusieurs gènes étrangers dans un tissu somatique particulier. Par exemple, des
protéines exogènes peuvent être produites dans le lait par l'introduction de gènes et d'éléments régulateurs
appropriés directement dans les cellules epitheliales mammaires, par exemple par des vecteurs rétroviraux
qui ciblent les cellules myoépithéliales en division rapide dans la glande mammaire. A la différence des
35 animaux transgéniques, qui transmettent le transgène à leur descendance au travers des générations
successives, les animaux transomiques ne transmettent pas la capacité de produire des protéines exogènes
dans leur lait mais doivent être créés individuellement. Néanmoins, ils peuvent être des sources de protéines
ou d'autres composants intéressants.
Un peptide exogène qui n'est normalement pas produit par le mammifère est connu sous le nom de
40 peptide hétérologue. Des exemples de peptides hétérologues que l'on peut trouver dans le lait d'animaux-7- ....... EP 0923308
domestiques comprennent les protéines du lait humain telles que la lactoferrine, les protéines du sérum
humain telles que les facteurs de coagulation sanguine, et les enzymes industrielles telles que la chitinase.
Un peptide qui est normalement produit par le mammifère particulier est connu sous le nom de peptide
endogène. Des exemples d'endogènes peuvent être rendus transgéniques pour exprimer une protéine de lait
5 endogène dans le but d'augmenter sa concentration, ou pour exprimer dans le lait une protéine que Ton
trouve normalement seulement dans le sérum. Par exemple, la transferrine bovine est normalement présente
en quantités infimes dans le lait, mais l'expression peut être augmentée de manière significative en générant
un animal transgénique portant le gène de lactoferrine sous le contrôle d'un gène d'alpha SI caséine
(publication PCT n° WO 93/25567).
10 Un peptide hétérologue peut co-exister avec une forme endogène du même peptide ou de la même
protéine qui est normalement produite par le mammifère transgénique. Les formes hétérologues et
homologues d'un peptide diffèrent habituellement par un ou plusieurs éléments parmi une séquence d'acides
aminés, une structure tertiaire ou quaternaire, une glycosylation ou une autre modification post-
traductionnelle. Par exemple, l'antithrombine m chez le mouton transgénique existe sous les deux formes,
15 humaine et ovine, qui peuvent se distinguer par des différences de séquence d'acides aminés qui peuvent
aboutir à des différences de charge superficielle de la protéine, d'hydrophobie, d'affinité de liaison pour des
métaux ou d'autres affinités. Pour des utilisations telles que les produits thérapeutiques ou pharmaceutiques
humains, les peptides humains sont préférés parce qu'ils ont moins de chance d'être reconnus comme des
protéines étrangères par les receveurs humains envisagés. Si des formes non humaines du peptide sont
20 présentes dans le lait du mammifère, il peut être nécessaire de les séparer de la protéine humaine exogène
dans le cadre du processus de purification.
La présente invention englobe tout composant exogène présentant un intérêt qui peut être présent
dans le lait, qu'il soit homologue ou hétérologue.
Le lait peut être traité par le procédé de la présente invention sous forme de lait entier cru, ou
25 pasteurisé, ou congelé. Ceci supprime la nécessité d'une première étape pour enlever les matières grasses,
les micelles de caséine, les lipides, les cellules somatiques, et d'autres matières particulaires, qui peuvent
être présents dans le lait et qui peuvent encrasser les membranes de filtration microporeuses ou les milieux
de Chromatographie. Typiquement, cette première étape est effectuée soit par précipitation des fractions
protéiques avec un acide ou de la présure, soit par centrifugation et élimination par écrémage des matières
30 grasses et des lipides pour produire du lait écrémé. Ces méthodes sont toutes connues pour emprisonner les
protéines et diminuer leur taux de récupération. De plus, les méthodes de précipitation exigent des étapes
supplémentaires pour resolubiliser et clarifier les protéines précipitées en vue d'un traitement ultérieur. Du
fait que la centrifugation en masse requiert un appareillage de grande dimension et coûteux, cette étape de
traitement ne peut être passée à plus grande échelle qu'en remplaçant les centrifugeuses existantes par des
35 plus grandes, en ajoutant plus de centrifugeuses et en en faisant fonctionner plusieurs en parallèle, ou en
traitant séquentiellement de multiples lots sur la ou les centrifugeuses existantes, prolongeant ainsi le temps
de traitement total.
De plus, le faible pH requis pour la précipitation des protéines peut réduire ou détraire l'activité
biologique de certains composants intéressants. Par exemple, l'inhibiteur de thrombine, l'antithrombine III,- 8 - EP 0923308
est instable aux valeurs de pH inférieures à environ 6,0 et est complètement inactivé aux valeurs de pH de
3-5, qui sont typiquement utilisées pour la précipitation à l'acide des protéines de caséine.
Dans la présente invention, les pertes dues à l'emprisonnement et à la sensibilité aux acides sont
supprimées par un procédé dans lequel le fractionnement préalable du lait entier n'est pas nécessaire. Selon
5 ce procédé, le lait est soumis directement à une filtration sur une membrane microporeuse. Des exemples de
filtration comprennent la filtration frontale et la filtration tangentielle. Dans la filtration frontale, la solution
à filtrer s'écoule perpendiculairement à la surface du filtre. Dans la filtration tangentielle, la solution à filtrer
s'écoule parallèlement au filtre et le perméat diffuse à travers celui-ci. Dans le procédé de cette invention, la
filtration se fait par filtration tangentielle.
10 Le filtre utilisé pour la filtration tangentielle a de préférence une porosité suffisante pour former un
perméat contenant le composant du lait intéressant et un rétentat contenant les matières grasses, cellules,
micelles de caséine, et matières particulaires. En général, les globules graisseux du lait peuvent être retenus
par les membranes ayant une taille de pore d'environ <1-10 micromètres, les cellules somatiques avec une
taille de pore d'environ 0,450 micromètre, les bactéries avec une taille de pore d'environ 0,200 micromètre,
15 les micelles de caséine avec une taille de pore d'environ 0,08-0,20 micromètre, les virus avec une taille de
pore d'environ 0,05-0,1 micromètre, les mycoplasmes avec une taille de pore de 0,1 micromètre, et les
prions avec une taille de pore d'environ 0,35 micromètre. Une membrane suffisante pour enlever les virus
est supposée enlever également les globules graisseux, les cellules somatiques, les bactéries, et les micelles
de caséine. Une taille de pore d'environ 0,05 micromètre correspond généralement à un seuil d'exclusion de
20 masse moléculaire d'environ 500 kD.
Habituellement, dans la filtration tangentielle sur une membrane d'ultrafiltration, le composant
intéressant est concentré dans le rétentat. Par exemple, la publication OEB n° 467482 décrit la purification
de protéines de lait combinées, par ultrafiltration de lait écrémé acidifié, suivie par une diafiltration et une
seconde ultrafiltration, retenant dans chaque cas les protéines dans le rétentat Ce qui est original dans la
25 présente invention, cependant, c'est l'utilisation d'une membrane d'ultrafiltration pour séparer les
composants solubles du lait dans le perméat. Le perméat ainsi formé est une solution limpide qui convient à
un traitement supplémentaire éventuel pour isoler et purifier le composant intéressant. Le rétentat reste avec
un aspect laiteux.
Eventuellement, le lait est d'abord combiné avec un agent chélatant dans des conditions douces en
30 une quantité suffisante pour empêcher le lait cru de prendre en masse et d'encrasser les membranes de
filtration et pour améliorer le passage du perméat à travers la membrane. Tel qu'on l'utilise ici, un agent
chélatant est défini comme tout agent capable de solubiliser des sels de calcium organiques ou
inorganiques. De préférence, l'agent chélatant est capable de chélater le calcium. Des exemples d'agents
chélatants qui chélatent efficacement le calcium sont l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), l'acide
35 éthylèneglycol-bis(béta-aminoéthyléther)-N,N,N,N-tétraacétique (EGTA), ou le citrate. De préférence,
l'agent chélatant est ajouté pour produire une concentration finale entre 1 et 500 mM. De préférence, la
concentration finale de l'agent chélatant est d'environ 20 à 50 mM d'EDTA ou 50 à 200 mM de citrate. Le
plus préférentiellement, la concentration finale de l'agent chélatant est d'environ 25 mM d'EDTA.-9- ..... EP 0923308
Dans certaines circonstances, le citrate peut être préféré par rapport au chélateur plus puissant
qu'est l'EDTA parce que le rejet d'EDTA peut faire l'objet d'une réglementation de l'environnement, selon la
quantité totale à rejeter, et donc peut être plus coûteux. L'EGTA a une constante d'affinité pour le calcium
plus élevée que celle de l'EDTA (R.M.C. Dawson, D.C. Elliott, W.H. Elliott, et K.M. Jones, Data for
5 Biochemical Research, 3?" édition, Clarendon Press, Oxford, 1986) et devrait être pareillement ou plus
efficace dans le procédé de cette invention.
Un autre avantage de ta présente invention est que les membranes qui ne deviennent pas encrassées
par colmatage sont plus facilement nettoyées et réutilisées. Par exemple, elles peuvent être nettoyées en
place par un lavage répété in situ avec des solvants appropriés tels que des acides, des bases et/ou des
10 alcools. Avant d'être réutilisées, ces membranes sont équilibrées avec des tampons appropriés pour enlever
toutes les traces des solvants. En proposant des procédés accessibles au recyclage des membranes de
filtration, qui peuvent coûter des dizaines de milliers de dollars dans les quantités requises pour une
purification à grande échelle, cette invention réduit substantiellement les coûts de traitement.
Dans le mode de réalisation préféré de cette invention, on combine dans un seul procédé séquentiel
15 une filtration tangentielle sur une membrane d'ultrafiltration avec une étape de capture pour enlever le
composant soluble du lait du perméat Le plus préférentiellement, la filtration tangentielle est effectuée avec
un système d'extraction continue en boucle fermée. Telle qu'on l'utilise ici, l'expression "système
d'extraction continue en boucle fermée" désigne un système dans lequel l'éluat issu de la procédure de
capture est combiné avec l'échantillon de lait initial (rétentat). Dans des modes de réalisation préférés, ceci
20 maintient le volume constant dans l'échantillon de lait initial évitant ainsi la nécessité d'ajouter une nouvelle
solution au système. Le perméat est amené jusqu'à un dispositif de capture pour isoler le composant soluble
du lait Tel qu'on l'utilise ici, le terme "dispositif de capture" désigne un dispositif autre qu'un filtre
tangentie! qui est capable de capturer un composant soluble du lait intéressant Ces dispositifs peuvent
inclure, mais sans y être limités, la Chromatographie d'affinité, la Chromatographie d'échange d'ions, la
25 Chromatographie hydrophobe, la Chromatographie en phase inverse, ou d'autres types de chromatographic
de capture qui sont connus de l'homme de l'art De préférence, le dispositif de capture est un dispositif de
Chromatographie, par exemple un dispositif de Chromatographie d'affinité. Des exemples de dispositifs de
Chromatographie d'affinité comprennent, mais sans y être limités, les colonnes d'affinité sur héparine, les
colonnes d'affinité sur Protéine A ou les colonnes d'affinité sur Protéine G. L'éluat issu de la procédure de
30 capture est ramené dans l'échantillon de lait initial (rétentat). Dans des modes de réalisation préférés, le
procédé est mis en ?uvre (ou l'étape est répétée ou continuée) jusqu'à ce que le composant soluble du lait
soit substantiellement récupéré. Les taux de récupération avec le procédé de l'invention sont d'au moins
environ 75%, 80%, 90%, ou 95% du composant soluble du lait intéressant De préférence, les taux de
récupération se situent dans la gamme de 75% à 90%, plus préférentiellement dans la gamme de 75% à
35 95%. La pureté du composant soluble du lait intéressant avec le procédé de l'invention est d'environ 80%,
85%, 90%, ou 95%. De préférence, la pureté est supérieure à environ 95%. Une représentation schématique
d'un exemple d'appareil utilisé pour mettre en ?uvre ce procédé est présentée à la figure t.
Dans les conditions qui maintiennent le volume constant et le passage de produit constant, ce
procédé de récupération peut être modélise par une équation de décroissance exponentielle, désignée ci-
40 après par Equation 1 :- 10- EP 0923308
Cr = Coxe-<vPxd/v°)
où: Cr est la concentration du composant désiré dans le rétentat
Co est la concentration de départ du composant désiré
Vo est le volume de départ
5 Vp est le volume total du perméat
d = est le coefficient de passage (ou le rapport Cr/Co à tout instant donné)
Par exemple, le procédé de cette invention peut être utilisé pour isoler l'antithrombine m à partir
de lait entier d'une chèvre transgénique. Dans ce cas, le lait serait traité par filtration tangentielle sur un
filtre de 500 kD suivie par une étape de capture sur une colonne de Chromatographie d'affinité sur héparine.
10 Dans les conditions qui maintiennent le flux constant, environ 40% de l'antithrombine III dans le rétentat
passe à travers la membrane à tout instant donné: autrement dit, le coefficient de passage, noté d dans
l'Equation 1, est égal à 0,4. L'Equation 1 prédit qu'après 7 volumes de lait dilué passés dans le perméat et
sur la colonne d'affinité d'héparine, on peut récupérer 94% de l'antithrombine UI dans l'échantillon de lait
initial. En pratique, les taux de récupération après 7 passages d'échantillon sont de 75-90%.
15 Le plus préférentiellement, l'effluent de ce dispositif de capture est ramené en ligne dans le
réservoir d'échantillon de lait initial contenant le rétentat. La quasi totalité du composant intéressant est
capturé, et le liquide issu du courant fluide est renvoyé dans le réservoir d'échantillon de lait initial. Les
quantités résiduelles du composant intéressant qui restent dans le rétentat peuvent être isolées en continuant
le processus de filtration/chromatographie.
20 Habituellement les procédés de filtration tangentielle continus tels que l'ultrafiltration et la
diafiltration sont effectués en ajoutant simultanément de Veau ou un tampon à la même vitesse que celle à
laquelle le perméat est éliminé. Ceci entraîne une augmentation significative du volume total de
l'échantillon et des solutions usées, et de la taille des récipients nécessaires pour les traiter et les contenir.
Cependant le procédé de cette invention maintient le volume constant. De préférence, la solution de lait est
25 maintenue aussi concentrée qu'il est possible pour permettre une filtration efficace sans colmatage de la
membrane. De plus, les divers composants du lait restent en équilibre, sauf pour l'élimination sélective du
composant intéressant. Avantageusement, le procédé décrit ici minimise le volume total d'échantillon de
départ, de rétentat et de perméat, le volume requis de tampon, la taille des récipients de collecte et des
réservoirs de tampon, la taille totale de l'installation physique et le nombre d'individus nécessaires pour
30 pourvoir en personnel l'installation de purification. Cette invention représente ainsi une économie de coûts
potentielle considérable par rapport aux procédés de purification classiques. Le perméat produit par la
filtration tangentielle selon le procédé de cette invention comprend une préparation partiellement purifiée
du composant intéressant.
Dans une autre application de la présente invention, ce perméat peut éventuellement être traité par
35 un ou plusieurs procédés supplémentaires pour enlever l'agent chélatant avec d'autres contaminants qui
peuvent être présents pour fournir une préparation purifiée du composant intéressant. Ce premier perméat
peut contenir des peptides supplémentaires ayant une masse moléculaire similaire à, plus élevée ou plus
faible que celle du composant intéressant. Il peut s'agir, par exemple, d'autres protéines de lait endogènes ou-11- ...... EP 0923308
des formes homologues de la protéine exogène. Des exemples de procédés supplémentaires convenant à une
purification supplémentaire comprennent la Chromatographie d'affinité, la Chromatographie d'échange
d'ions, la Chromatographie hydrophobe, la Chromatographie thiophilique, la Chromatographie avec chelate
métallique, la Chromatographie en phase inverse ou des procédés de filtration tels que l'ultrafiltration. La
5 Chromatographie d'affinité peut être conduite avec des ligands qui se lient spécifiquement ou
préférentiellement au composant intéressant, tels qu'un anticorps, la Protéine A, la Protéine G ou, dans le
cas de l'antithrombine lu, l'héparine.
EXEMPLE 1: ISOLEMENT D'UNE ANTITHROMBINE IU BIOLOGIQUEMENT ACTIVE À PARTIR
DE LAIT
10 Du lait a été collecté chez des chèvres transgéniques exprimant l'antithrombine III et congelé à
-35°C. Le lait congelé a été décongelé soit pendant une nuit dans une chambre froide à 8±3°C, soit dans un
bain-marie à <40°C avec un brassage manuel intermittent jusqu'à ce que la décongélation soit complète. Un
échantillon d'environ 23 kg de lait décongelé a été combiné avec un poids égal d'une solution contenant de
l'EDTA 50 mM et du chlorure de sodium 180 mM, pH 9,1, à 8±3°C.
15 Le lait dilué a été placé dans une cuve d'alimentation et clarifié à 8±6°C par filtration tangentielle
dans un système d'extraction continue illustré schématiquement sur la figure 1. Des cartouches à membrane
en fibres creuses avec un seuil d'exclusion de masse moléculaire de 500 (kD) (UFP-500-E; A/G Technology
Corp., Needham MA) ont été équilibrées avec une solution contenant de l'EDTA 10 mM et du chlorure de
sodium 180 mM à pH 6,8. Le lait a été mis à circuler à travers six cartouches de 0,7 m^ organisées en trois
20 piles parallèles de deux à un débit <45 1/min établi au moyen d'une pompe centrifuge. La pression d'entrée a
été ajustée à 15±2 psi (livres par pouce carré) par une vanne à membrane. Le débit du perméat a été régulé
au moyen d'une pompe doseuse pour maintenir la pression transmembranaire du perméat à 0-5 psi. Un
échangeur thermique (non représenté sur la figure 1) a été inclus dans le circuit juste avant les cartouches de
filtration pour maintenir la température de la solution proche de 8°C.
25 Le perméat contenant l'antithrombine QI a été envoyé par pompage directement en ligne dans une
colonne de Chromatographie d'affinité équilibrée contenant de l'héparine derivatisée servant de ligand. La
résine Heparin HyperD (BioSepra Inc., Marlborough, MA) a été garnie dans une colonne
chromatographique pour créer un volume de lit total de 6,1±0,7 litres et équilibrée avec de l'EDTA 10 mM
dans du chlorure de sodium 180 mM, pH 6,8 à 8±3°C. L'effluent de la colonne d'héparine a été renvoyé
30 directement dans la cuve d'alimentation. L'échantillon de lait, à présent combiné avec le rétentat de filtration
et l'effluent de la colonne d'héparine, a été mis à recirculer jusqu'à ce qu'un total de 7 volumes de lait dilué
soit passé à travers les cartouches de filtration. La colonne d'héparine a ensuite été déconnectée de l'unité de
filtration tangentielle et a été lavée avec un tampon contenant du phosphate de sodium 20 mM et du
chlorure de sodium 400 mM, pH 7,0. L'antithrombine III a été éluée avec un tampon contenant du
35 phosphate de sodium 20 mM et du chlorure de sodium 2,5 M, pH 7,0. La protéine dans l'effluent de la
colonne a été détectée avec un détecteur d'absorbance UV équipé d'un filtre à 280 nm.
Le procédé entier de filtration tangentielle et de Chromatographie sur héparine a pris environ 6-8
heures. Nous avions préalablement démontré que dans les conditions décrites ici, le flux à travers ce type de
cartouche d'ultrafiltration à fibres creuses de 500 kD restait constant pendant 4 heures. Des expériences- 12- EP 0923308
antérieures ont également établi que d'autres types de membranes, tels que les membranes Durapore de 0,1
micromètre, 0,2 micromètre et 0,45 micromètre, étaient moins appropriés pour la filtration tangentielle dans
les conditions stipulées ici parce que le flux diminuait significativement sur une période de filtration d'essai
de 30 min.
5 Une Chromatographie en phase inverse quantitative a été utilisée pour mesurer la protéine
antithrombine III totale dans l'échantillon de lait de départ et l'éluat final de la colonne d'héparine. Une
colonne PORÖS R2/H (produit n° 1-1114-12, PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) a été utilisée
conformément aux instructions du fabricant Un gradient de colonne de 0,1% d'acide trifluoroacétique
(TFA) dans l'eau jusqu'à 0,1% de TFA dans 99,9% d'acétonitrile a été établi à un débit de 2,0 ml par minute,
10 et a été étalonné avec une solution étalon d'antithrombine JÜ. La teneur en antithrombine IU a été interpolée
à partir d'une courbe d'étalonnage linéaire.
L'activité biologique de l'antithrombine DT a été déterminée par un test d'inhibition de thrombine
qui mesurait le degré auquel l'antithrombine III dans les échantillons inhibait la coupure du substrat Kabi
S2238 (dichlorhydrate de H-D-phénylalanyl-L-pipécolyl-L-argirune-p-nitroaniline) par une quantité étalon
15 de thrombine. De l'héparine, qui se lie à la fois à la thrombine et à l'antithrombine DT, a été ajoutée dans
chaque échantillon d'essai pour augmenter l'activité d'inhibition d'antithrombine IH. L'héparine et la
thrombine ont été incubées dans des plaques à micropuits avec des aliquotes soit d'échantillons du procédé
soit de dilutions d'une solution étalon d'antithrombine ni. Après incubation pendant 15 min à 37°C, la
réaction a été stoppée avec de l'acide acétique glacial, et l'absorbance a été mesurée à 405 nm. L'activité de
20 l'antithrombine III a été interpolée à partir d'une courbe d'étalonnage linéaire.
Cette combinaison d'une filtration tangentielle et d'une Chromatographie d'affinité sur héparine a
donné régulièrement un taux de récupération de 75% à 90%, avec une pureté dépassant 95%. Des résultats
pour un essai de purification typique pour le lot AT501 sont présentés dans le tableau 1. L'échantillon de lait
de départ de 24 litres contenait un total de 55 g d'antithrombine III, dont 42 g (75%) ont été récupérés à
25 partir de la colonne d'affinité d'héparine. Le pool de produit final avait une activité spécifique de 7,8
unités/mg, qui est comparable à celle de l'antithrombine m dérivée du plasma.
EXEMPLE 2: EFFET DE L'EDTA SUR LA FILTRABILITÉ DU LAIT ENTIER
Des aliquotes de 20 ml de lait de chèvre entier, congelé et décongelé comme décrit dans l'exemple
1, ont été combinées avec 20 ml d'EDTA 50 mM ou 20 ml d'eau déminéralisée distillée, et ajustées à
30 différents pH sur la gamme de 6 à 10 avec HCl ou NaOH concentré. Chaque solution a été diluée deux fois
de plus avec de l'eau déminéralisée distillée jusqu'à des dilutions de lait finales de 1/16 et 1/32 (vol/vol).
Les échantillons individuels ont été pompés à travers des filtres Millex-GV stériles de 0,22 micromètre
(Millipore Corp., Bedford, MA) à des débits de 3 ml/min jusqu'à ce qu'une pression de 20 psi au manomètre
soit atteinte. Les perméats ont été récupérés dans des petits tubes prépesés. Chaque filtration a été effectuée
35 en double. Les tubes ont été pesés pour calculer le perméat total en grammes, et ceci a été converti en
volume. Les témoins ont été traités exactement de la même manière à ceci près qu'ils n'ont pas reçu
d'EDTA. Dans certains cas, l'activité de l'antithrombine III a été mesurée dans les perméats par le test
d'inhibition de thrombine comme décrit dans l'exemple 1.- 13- EP 0923308
Le lait dilué dans l'eau seule à pH < est passé facilement à travers les filtres à une dilution finale de
1/32 (figure 3). En revanche, l'addition d'EDTA a augmenté la filtrabilité à tous les pH et à toutes les
concentrations testées. L'EDTA était particulièrement efficace aux dilutions inférieures testées, ce qui
correspondrait à un volume de traitement total plus petit dans les opérations de purification à échelle réelle.
5 Dans une expérience séparée, une augmentation d'un facteur 2 de la concentration d'EDTA à pH 8 a donné
une augmentation d'au moins un facteur 2 du poids total de lait filtré sur la gamme de 6,25 à 25 mM
d'EDTA (données non présentées).
EXEMPLE 3: EFFET DE DIFFÉRENTS AGENTS CHÉLATANTS SUR L'ISOLEMENT D'UNE
PROTÉrNE SOLUBLE DU LAIT
10 Du lait de la chèvre transgénique 155-10, qui exprimait rantithrombine III, a été collecté, congelé
et décongelé comme décrit dans l'exemple 1. Des échantillons de 160 ml de lait décongelé ont été combinés
avec un poids égal de tampon contenant soit de l'EDTA soit du citrate comme agent chélatant
Le tampon citrate contenait du citrate de sodium 166 mM et de l'acide citrique 10 mM, pH 7,0. Le
lait dilué a été clarifié à 8±6°C par filtration tangentielle dans un système d'extraction continue tel que décrit
15 sur la figure 1, mais à une échelle plus petite. Une cartouche à membrane à fibres creuses avec un seuil
d'exclusion de masse moléculaire de 500 kD (UFP-500-E-4; A/G Technology Corp., Needham, MA) a été
équilibrée avec une solution contenant du citrate de sodium 118 mM et de l'acide citrique 7 mM, pH 7,0. Le
lait a été mis à circuler à travers une cartouche de 0,032 m^ à 2,5 1/min au moyen d'une pompe péristaltique.
La pression d'entrée a été ajustée à 15±2 psi avec une pince pour tubes. Une seconde pompe péristaltique a
20 été utilisée pour maintenir le débit à 18 ml/min et la pression à 2-6 psi.
Le perméat contenant rantithrombine III a été pompé directement en ligne jusque dans une
colonne d'affinité Heparin HyperD (BioSepra Inc., Marlborough, MA) équilibrée. La colonne faisait 76 ml
et était équilibrée avec du citrate de sodium 118 mM et de l'acide citrique 7 mM, pH 7,0 à 8±6°C.
Le perméat a été passé directement sur la colonne d'héparine et l'effluent de la colonne d'héparine a
25 été renvoyé dans le réservoir de rétentat dans un système d'extraction continue en boucle fermée.
Après le passage de 13 volumes de lait dilué à travers les cartouches de filtration, la colonne
d'héparine a été déconnectée de l'unité de filtration tangentielle. La colonne d'héparine a été lavée avec un
tampon contenant du phosphate de sodium 20 mM et du chlorure de sodium 400 mM, pH 7,0.
L'antithrombine UI a été éluée de la colonne d'héparine avec un tampon contenant du phosphate de sodium
30 20 mM et du chlorure de sodium 2,5 M, pH 7,0. La protéine dans l'élution de la colonne a été détectée avec
un détecteur d'absorbance UV équipé d'un filtre à 280 nm. Le procédé entier de filtration tangentielle et de
Chromatographie sur héparine a pris environ 6 heures.
Le lait entier combiné avec l'EDTA en tant qu'agent chélatant a été traité de manière similaire à
cette échelle au moyen des tampons et des solutions de lavage de colonne décrits dans l'exemple 1.
35 Des aliquotes d'antithrombine III purifiée ont été séparées par électrophorèse sur un gel de
polyacrylamide-SDS avec un gradient de 10-20% (Owl Scientific, Wobum, MA) et colorées à l'argent
conformément aux méthodes standards pour l'évaluation qualitative de la pureté des protéines. La figure 4
montre des effluents de colonnes d'héparine provenant des échantillons EDTA et citrate (pistes 3 et 5,
respectivement), et la protéine éluée à partir des procédés EDTA et citrate (pistes 7 et 9, respectivement).- 14-........ EP 0923308
Les étalons de masse moléculaire provenaient de BioRad Hercules, CA (produit n° 161-0304). Des niveaux
de pureté similaires ont été obtenus à partir de chacun des deux procédés EDTA et citrate. Comme
déterminé par Chromatographie en phase inverse quantitative, le taux de récupération d'activité
d'antithrombine ni était de 81% avec l'EDTA et de 90% avec le citrate.
5 EXEMPLE 4: ISOLEMENT D'UN ANTICORPS MONOCLONAL BIOLOGIQUEMENT ACTIF À
PARTIR DE LAIT
Du lait collecté chez la chèvre transgénique 395-94, qui exprimait un anticorps monoclonal IgG, a
été congelé, décongelé, combiné avec de l'EDTA et traité essentiellement de la manière décrite dans
l'exemple 1. L'échantillon a été soumis à une filtration tangentielle soit à travers un filtre en fibres creuses
10 ayant un seuil d'exclusion de masse moléculaire de 500 kilodaltons (kD) (modèle UFP-500-E-3A, A/G
Technology Corp., Needham, MA) soit à travers un filtre en fibres creuses de 0,1 micron (modèle CFP-l-E-
3A, A/G Technology Corp., Needham, MA). Dans les deux cas, le perméat a été amené directement sur une
colonne de Chromatographie d'affinité sur Protéine G (Pharmacia, Piscataway, NJ). Les colonnes ont été
équilibrées avec du phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,0 et une fois l'étape de filtration tangentielle terminée,
15 lavées avec du phosphate de sodium 0,1 M, pH 7,0 et éluées avec de l'acide citrique 0,1 M, pH 2,2. La
pureté de l'IgG dans l'échantillon de lait initial était d'environ 21%, telle que déterminée par
Chromatographie en phase inverse quantitative. Après filtration tangentielle et Chromatographie sur Protéine
G, la pureté de l'IgG était de 82% pour la matière filtrée à 0,1 micron et de 99% pour la matière filtrée à
500 kD.
20 EXEMPLE 5: ISOLEMENT DE L'INHIBITEUR D'ALPHA-1 PROTEINASE À PARTIR DE LAIT
Du lait collecté chez une chèvre transgénique (398-94) exprimant l'inhibiteur humain de l'alpha-1
proteinase (A1PI) a été congelé, décongelé, combiné avec un volume égal d'arginine 20 mM, pH 7,2 et
traité par filtration tangentielle couplée à une colonne de Chromatographie de Q-Sepharose FF (Pharmacia,
Piscataway, NJ) essentiellement de la manière décrite dans l'exemple 1. Le lait dilué a été soumis à une
25 filtration tangentielle sur un filtre en fibres creuses ayant un seuil d'exclusion de masse moléculaire de 750
kilodaltons (modèle UFP-750-E-3X2, A/G Technology Corp., Needham, MA). Le perméat a été amené
directement sur une colonne de Q-Sepharose FF (1,1 cm x 24 cm). La colonne était équilibrée avec du
phosphate de sodium 20 mM, NaCl 1,25 mM, pH 7,0. Une fois l'étape de filtration tangentielle/capture
terminée (2 h), la colonne a été lavée avec du phosphate de sodium 20 mM, NaCl 5 mM, pH 7,0 puis l'Ai PI
30 a été élue de la colonne avec du phosphate de sodium 20 mM, NaCl 75 mM, pH 7,0. La pureté de l'Ai PI
dans le lait était d'environ 4% telle que déterminée par Chromatographie en phase inverse quantitative.
Après l'étape de clarification et de Chromatographie sur Q-Sepharose FF, réalisée selon un mode
d'extraction continue en boucle fermée, la pureté de l'Ai PI transgénique était de 91% avec un taux de
récupération de 89%.
35 EXEMPLE 6: ELIMINATION DES VIRUS D'UNE PRÉPARATION BIOLOGIQUE
Des études d'élimination de virus ont été effectuées sur le procédé de cette invention par un
organisme de recherche sous contrat selon des méthodes d'évaluation normalisées. L'isolement
d'antithrombine HI à partir de lait entier a été effectué de la manière décrite dans l'exemple 1, à ceci près
que le procédé a été réalisé à une échelle réduite en utilisant des colonnes d'un diamètre plus étroit avec les- 15- EP 0923308
mêmes hauteurs de ht que celles utilisées dans la production à l'échelle du procédé. D'autres paramètres clés
sont restés inchangés, tels que le rapport de la protéine antithrombine ni au volume de lit de la colonne dans
la colonne d'affinité d'héparine, les débits linéaires, les rapports de volume de tampon au volume de
colonne, la composition des tampons et la température.
5 Quatre virus ont été sélectionnés en tant que représentants de la catégorie des types de virus
pathogènes auxquels les chèvres en Amérique du Nord pourraient être sensibles. Deux virus à enveloppe
ont été testés: le retrovirus murin xénotrope, un virus à ARN simple brin de la famille des retrovirus, qui a
été testé sur des cellules cibles Mink S+L; et le virus de la pseudorage, un virus à ADN double brin de la
famille des herpesvirus, qui a été testé sur des cellules PK-13 (ATCC CRL 6489). Deux virus non
10 enveloppés ont été testés: le polio virus Sabin type 1, un virus à ARN simple brin de la famille des
Picornavirus, testé sur des cellules Vero (ATCC CCL 81); et l'adénovirus de souris, un virus à ADN double
brin de la famille des adenovirus, testé sur des cellules 3T3 BALB/c.
Les échantillons de lait ont été chargés séparément avec des inoculums connus de chaque virus et
traités par filtration tangentielle et Chromatographie sur colonne d'affinité d'héparine. La solution de dépôt
15 pour la colonne d'héparine a également été inoculée séparément Les effluents des deux colonnes ont été
testés individuellement sur des cultures de chaque type de cellule cible. La colonne de filtration tangentielle
a régulièrement donné une bonne réduction virale avec les quatre virus, et le virus de la pseudorage et le
retrovirus murin xénotrope plus grands ont été complètement éliminés. La colonne d'affinité d'héparine a
donné une réduction virale, en log, de 2-4. Les résultats sont regroupés dans le tableau 2.
20 TABLEAU 1. Isolement d'antithrombine III à partir du lait de chèvres transgéniques par le procédé de cette
invention, au moyen d'une filtration tangentielle combinée à une Chromatographie d'affinité sur héparine.
Les résultats sont présentés pour une purification typique pour le lot AT501, comme décrit dans l'exemple
1. L'activité de l'antithrombine UI (ATHI) a été mesurée par le test d'inhibition de thrombine et exprimée en
kilounités (kU); la protéine ATHI totale a été mesurée par Chromatographie en phase inverse quantitative.
Activité ATHI Protéine ATIII totale,
Etape Volume, 1 ATITI, kU/ï totale, kU ATHI, g/l g % Rendement
Lait 23,9 19,2 457 2,32 55,3 100
Lait dilué 47,0 10,3 . 485 1,13 53,2 96
Perméat 331
Eluat héparine 8,0 49,1 390 5,24 41,7 75
-16- EP 0923308
TABLEAU 2. Réduction de virus par le procédé d'isolement d'antithrombine tn, mesurée en chargeant
chaque colonne séparément avec des inoculums de virus et en cultivant les effluents de colonne sur des
cellules cultivées cibles appropriées.
Réduction en log(10)
Virus Colonne de filtration Colonne d'affinité Total
tangentielle d'héparine
2,9 >7,2
1,2 >5,4
Virus à enveloppe
retrovirus murin xénotrope >4,3
virus de la pseudorage >4,2
Virus non enveloppés
poliovirus Sabin type l 4,1
adenovirus de souris 3,5
4,0 8,1
2,3 5,8-17- ....... EP 0923308
REVENDICATIONS
1. Procédé de séparation d'un composant exogène soluble qui est introduit par transfert de gène dans
un animal transgénique ou transomique à partir de lait ou d'une fraction de lait, consistant :
5 a) à soumettre le lait ou la fraction de lait à une filtration tangentielle sur une membrane de
porosité suffisante pour former un rétentat et un perméat comprenant le composant exogène soluble;
b) à soumettre le perméat à un dispositif de capture pour enlever substantiellement le
composant exogène soluble, et à fournir un effluent;
c) à combiner l'effluent avec le rétentat; et
10 d) à répéter les étapes a) à c) jusqu'à ce que le composant exogène soluble soit
substantiellement récupéré, la récupération du composant exogène étant de 75-95%.
2. Procédé de la revendication 1 dans lequel le lait ou la fraction de lait est combiné(e) avec un agent
chélatant en une quantité suffisante pour réduire la prise en masse du lait et pour améliorer le passage à
travers la membrane de filtration
15 3. Procédé de la revendication 2 dans lequel l'agent chélatant est choisi dans le groupe constitué de
l'EDTA, de l'EGTA et du citrate.
4. Procédé de la revendication 3 dans lequel l'agent chélatant est ajouté à une concentration finale
comprise entre 1 et 500 millimolaire.
5. Procédé de la revendication 3 ou 4 dans lequel l'agent chélatant est l'EDTA.
20 6. Procédé de la revendication 5 dans lequel l'EDTA est ajouté à une concentration finale d'environ
25 millimolaire.
7. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le composant est un
peptide ou une protéine.
8. Procédé de la revendication 7 dans lequel la protéine est choisie dans le groupe constitué des
25 glycoprotéines, des immunoglobulines, des peptides, des hormones, des enzymes, des protéines sériques,
des protéines du lait, des protéines cellulaires, des récepteurs solubles et des enzymes industrielles.
9. Procédé de la revendication 8 dans lequel la protéine est choisie dans le groupe constitué de
l'érythropoiétine, l'inhibiteur de l'alpha-1 proteinase, la phosphatase alcaline, l'angiogénine, l'antithrombine
HI, la chitinase, la superoxyde dismutase extracellulaire, le facteur VIH, le facteur LX, le facteur X, le
30 fibrinogène, la glucocérébrosidase, la glutamate decarboxylase, la serumalbumine humaine, l'insuline, la
protéine basique de la myéline, la lactoferrine, la lactoglobuline, le lysozyme, la lactalbumine, la
proinsuline, le CD4 soluble, le composant et les complexes du CD4 soluble, l'activateur tissulaire du
plasminogène et un de leurs variants.
10. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le filtre tangentiel a une
35 porosité suffisante pour retenir la quasi totalité des graisses, micelles de caséine, cellules somatiques et
matière particulaire dans le rétentat- 18- EP 0923308
11. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le filtre tangentiel a une
taille de pore comprise entre 0,1 et 1000 nanometres.
12. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel les bactéries,
mycoplasmes, virus, particules de prion et les contaminants microbiens présents dans le lait cru sont
5 substantiellement éliminés.
13. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le dispositif de capture est
un dispositif de capture par Chromatographie.
14. Procédé de la revendication 13 dans lequel le dispositif de capture par Chromatographie est un
dispositif de capture par Chromatographie d'affinité.
10 15. Procédé de la revendication 14 dans lequel le dispositif de capture par Chromatographie d'affinité
est choisi dans le groupe constitué d'une colonne d'héparine, d'une colonne de Protéine A et d'une colonne
de Protéine G.
16. Procédé de la revendication 13 dans lequel le dispositif de capture par Chromatographie est un
dispositif de capture par Chromatographie d'échange d'ions.
15 17. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le lait est obtenu auprès
d'un mammifère non humain en lactation choisi dans le groupe comprenant des mammifères transgéniques
et des mammifères transomiques.
18. Procédé de la revendication 17 dans lequel le lait est obtenu auprès d'une vache, chèvre, truie,
lapine, souris, rate ou brebis, qui est transgénique.
20 19. Procédé de l'une quelconque des revendications précédentes lorsqu'il est effectué dans un système
d'extraction continue en boucle fermée.-19-
EP 0923308
Sortie
Cuve
d'alimentation
Cartouche
TFF
Perméat
Effluent de
colonne
1hë__-#^b
FIGURE 1-20-
EP 0923308
fi
? rm
O
e
ffi x s ffi *£
a a o. .a. q.
c
o
H
?S 'S S
9 2°
£ E S
*o -« >33
i ' ! ??'
O O < t*
iii:
en
T
tN
g
? rm
S
Q
S9J4JTJ ira
FIGURE 3A-21-
EP 0923308
<
H
Q
UJ
sarnrj: [in
FIGURE 3B-22-
EP 0923308
Piste no
FIGURE 4