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Numéro de publication : 1175909
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Nom du titulaire : YALE UNIVERSITY
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brevet européen tel que délivré et une copie 1'OEB Form 2006.
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N° de publication européen : 1175909
N° de dépôt de la demande : 01120663.8
N° et date du bulletin européen des brevets dans lequel
a été publiée la demande : 09/11 du 11.03.2009
1. INTRODUCTION
La présente description concerne les compositions
thérapeutiques comprenant les protéines Notch, leurs
analogues et dérivés, les anticorps contre celles-ci,
les acides nucléiques codant pour les protéines Notch,
10 dérivés ou analogues, les acides nucléiques antisens
Notch et les protéines toporythmiques qui se lient à
Notch et leurs acides nucléiques et anticorps. Des
procédés thérapeutiques et diagnostiques sont également
proposés.
15
2. ARRIERE-PLAN DE L'INVENTION
2.1 LE GENE ET LA PROTEINE NOTCH
Des mutations nulles dans l'un quelconque des
locus neurogéniques zygotiques (Notch (N) , Delta (DI),
20 mastermind (mam), Enhancer of Split (E(spl)),
neutralisé (neu) et big brain (bib)) entraînent une
hypertrophie du système nerveux aux dépens des
structures épidermiques ventrale et latérale. Cet effet
est dû à un mauvais acheminement des cellules
25 précurseurs épidermiques dans une voie neuronale et
implique que la fonction de gène neurogène soit
nécessaire pour faire passer les cellules de la région
neurogène d'une évolution neuronale à une évolution
epitheliale. Des études qui ont évalué les effets de
30 l'ablation au laser de neuroblastes embryonnaires
spécifiques (Doe et Goodman, 1985, Dev. Biol. 111, 206-
219) ont montré que les interactions cellulaires entre
les neuroblastes et les cellules accessoires
environnantes servent à empêcher ces cellules
5 accessoires d'adopter une destinée neuroblastique.
Associées, ces observations génétiques et
développementales ont conduit à l'hypothèse selon
laquelle les produits de protéine des locus neurogènes
en tant que composants d'un mécanisme d'interaction
10 cellulaire sont nécessaires pour le développement
épidermique approprié (Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends
Genet. 4. 95-100).
Les analyses de séquence (Wharton et coll., 1985,
Cell 43, 567-581 ; Kidd et coll., 1986, Mol. Cell. Biol.
15 6, 3094-3108 ; Vassin et coll., 1987, EMBO J. 6, 3431-
3440 ; Kopczynski et coll., 1988, Genes Dev. 2, 1723-
1735) ont montré que deux des locus neurogènes, Notch
et Delta, codent apparemment pour les protéines
transmembranaires qui entourent la membrane une fois
20 unique. Le gène Notch de Drosophila code pour une
protéine de ~ 300 kd (nous utilisons le terme "Notch"
pour désigner cette protéine) comportant un grand
domaine extracellulaire N-terminal qui comprend
36 répétitions en tandem de type facteur de croissance
25 épidermique (EGF) suivies de trois autres répétitions
riches en cysteine, nommées répétitions Notch/lin-12
(Wharton et coll., 1985, Cell 43, 567-581 ; Kidd et
coll., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094-3108 ; Yochem et
coll., 1988, Nature 335, 547-550). Des séquences de
30 Xenopus (Coffman et coll., 1990, Science 249 : 1438-
1441) et un homologue Notch humain nommé TAN-1 (Ellisen
et coll., 1991, Cell 66 : 649-661) ont également été
rapportées. Delta code pour une protéine de ~ 100 kd
(nous utilisons le terme "Delta" pour désigner DLZM, le
produit de protéine des produits de transcription
5 zygotiques et maternels prédominants ; Kopczynski et
coll., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) qui a neuf
répétitions de type EGF dans son domaine
extracellulaire (VAssin et coll., 1987, EMBO J. 6,
3431-3440 ; Kopczynski et coll., 1988, Genes Dev. 2,
10 1723-1735). Bien que l'on sache peu de choses sur
l'importance fonctionnelle de ces répétitions, le motif
de type EGF a été observé dans diverses protéines
comprenant celles impliquées dans la cascade de la
coagulation sanguine (Furie et Furie, 1988, Cell 53,
15 505-518) . En particulier, ce motif a été observé dans
les protéines extracellulaires telles que les facteurs
de coagulation sanguine IX et X (Rees et coll., 1988,
EMBO J. 7, 2053-2061 ; Furie et Furie, 1988, Cell 53,
505-518), dans d'autres gènes de Drosophila (Knust et
20 coll., 1987, EMBO J., 761-766 ; Rothberg et coll., 1988,
Cell 55, 1047-1059) et dans certaines protéines de
récepteur de surface cellulaire telles que la
thrombomoduline (Suzuki et coll., 1987, EMBO J. 6,
1891-1897) et le récepteur LDL (Sudhof et coll., 1985,
25 Science 228, 815-822) . Un site, de liaison protéique a
été cartographie jusqu'au domaine de répétition EGF
dans la thrombomoduline et 1'urokinase (Kurosawa et
coll., 1988, J. Biol. Chem. 263, 5993-5996 ; Appella et
coll., 1987, J. Biol. Chem. 262, 4437-4440). .
3 0 Une série fascinante d'interactions entre les
mutations Notch et Delta a été décrite (Vassin et coll.,
1985, J. Neurogenet. 2, 291-308 ; Shepard et coll.,
1989, Genetics 122, 429-438 ; Xu et coll., 1990, Genes
Dev. 4, 464-475). Un certain nombre d'études génétiques
(résumées par Alton et coll., 1989, Dev. Genet. 10,
5 261-272) ont montré que les dosages du gène de Notch et
Delta en relation l'un par rapport à l'autre sont
essentiels pour le développement normal. Une réduction
de 50 % de la dose de Delta dans un arrière-plan Notch
de type sauvage entraîne un élargissement des veines de
10 l'aile créant un "delta" à la base (Lindsley et Grell,
1968, n° de publication 627, Washington DC, Carnegie
Institute of Washington). Un phénotype similaire est
provoqué par une augmentation de 50 % de la dose de
Notch dans un arrière-plan Delta de type sauvage (un
15 phénotype "Confluens" ; Welshons, 1965, Science 150,
1122-1129). Ce phénotype Delta est partiellement
supprimé par une réduction du dosage de Notch. Des
travaux ont montré que des interactions létales entre
les alleles qui correspondent à des altérations des
20 répétitions de type EGF de Notch peuvent être évitées
en réduisant la dose de Delta (Xu et coll., 1990, Genes
Dev. 4, 464-475). Xu et coll. (1990, Genes Dev. 4, 464-
475) ont constaté que des mutations nulles au niveau de
Delta ou mam suppriment les interactions létales entre
25 des combinaisons hétérozygotes de certains alleles
Notch connus sous le nom de mutations Abruptex (Ax) .
Les alleles Ax sont associés à des mutations faux-sens
dans les répétitions de type EGF du domaine
extracellulaire de Notch (Kelley et coll., 1987, Cell
30 51, 539-548 ; Hartley et coll., 1987, EMBO J. 6, 3407-
3417).
Des études récentes ont montré que Notch et Delta
et Notch et Serrate interagissent directement sur le
niveau moléculaire (Fehon et coll., 1990, Cell 61 :
523-534 ; Rebay et coll., 1991, Cell 67 : 687-699).
5 Notch est exprimé sur des processus axonaux
pendant l'excroissance des neurones embryonnaires
(Johansen et coll., J. Cell Biol. 109 : 2427-2440 ;
Kidd et coll., 1989, Genes Dev. 3 : 1113-1129 ; Fehon
et coll., 1991, J. Cell Biol. 113 : 657-669).
10 Une étude a montré que certains alleles Ax de
Notch peuvent modifier sévèrement la recherche d'une
voie axonique durant 1'excroissance neurale sensorielle
dans les disques imaginaux, bien que l'on ne sache pas
encore si l'expression aberrante de Notch dans l'axone
15 lui-même ou 1'epithelium le long duquel il se développe
est responsable de ce défaut (Palka et coll., 1990,
Development 109, 167-175).
2.2. CANCER
20 Un néoplasme, une tumeur, est une masse
néoplasique résultant d'une croissance cellulaire
anormale incontrôlée qui peut entraîner un gonflement
de la surface corporelle et qui peut être bénigne ou
maligne. Les tumeurs bénignes restent généralement
25 localisées. Les tumeurs malignes sont nommées
collectivement cancers. Le terme "malin" signifie
généralement que la tumeur peut envahir et détruire les
structures corporelles voisines et s'étendre à des
sites distants entraînant la mort (pour un tour
30 d'horizon, voir Robbins et Angell, 1976, Basic
Pathology, 2ème éd., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp.
68-122).
Un traitement efficace et la prévention du cancer
restent une nécessité constante et un objectif majeur
5 de la recherche biomédicale.
3. RESUME DE LA DESCRIPTION
La présente description concerne des procédés
thérapeutiques et diagnostiques et des compositions à
10 base de protéines et d'acides nucléiques Notch. La
description concerne le traitement des perturbations de
la destinée cellulaire ou de la différenciation
cellulaire par l'administration d'un composé
thérapeutique de l'invention. Ces composés
15 thérapeutiques (nommés ici "produits thérapeutiques")
comprennent les protéines Notch et leurs analogues et
dérivés (comprenant les fragments) de ceux-ci ; les
anticorps contre ceux-ci ; les acides nucléiques codant
pour les protéines Notch, analogues ou dérivés ; les
20 acides nucléiques antisens Notch ainsi que les
protéines toporythmiques et leurs dérivés qui se lient
ou interagissent d'une autre façon avec les protéines
Notch et leurs acides nucléiques codants et anticorps.
Un produit thérapeutique peut être administré pour
25 traiter une pathologie cancéreuse ou pour éviter la
progression d'un état prénéoplasique ou non malin à un
état néoplasique ou malin. Un produit thérapeutique
peut être administré pour traiter un trouble du système
nerveux ou pour favoriser la régénérescence et la
3 0 réparation.
Les produits thérapeutiques qui antagonisent ou
inhibent la fonction Notch (désignés ci-après "produits
thérapeutiques antagonistes") sont administrés pour
assurer un effet thérapeutique ; les troubles qui
5 peuvent ainsi être traités peuvent être identifiés par
des essais in vitro tels que ceux décrits au paragraphe
5.1, ci-dessous. Ces produits thérapeutiques
antagonistes comprennent, de façon non restrictive, les
acides nucléiques antisens de Notch, les anticorps
10 neutralisants anti-Notch et les inhibiteurs compétitifs
des interactions protéine-protéine de Notch (par
exemple, une protéine comprenant ELR-11 et ELR-12 de
Notch et leurs dérivés), tous étant détaillés ci-
dessous.
15 Les produits thérapeutiques qui favorisent la
fonction Notch (désignés ci-après "produits
thérapeutiques antagonistes") sont administrés pour
obtenir un effet thérapeutique ; les troubles qui
peuvent ainsi être traités peuvent être identifiés par
20 des essais in vitro tels que ceux décrits au paragraphe
5.1, ci-dessous. Ces produits thérapeutiques
antagonistes comprennent, de façon non restrictive, les
protéines Notch et leurs dérivés comprenant le domaine
intracellulaire et les protéines qui interagissent avec
25 Notch (par exemple, une protéine comprenant une
séquence Delta homologue à celle des acides aminés
Delta 1-230 de Drosophila (voir figure 1 et SEQ ID
N° : 2) ou comprenant une séquence Serrate homologue à
celles des acides aminés Serrate 79-282 de Drosophila
30 (voir figure 5 et SEQ ID N° : 4)).
Les perturbations de la destinée cellulaire, en
particulier les troubles hyperprolifératifs (par
exemple le cancer) ou hypoprolifératifs comprenant des
niveaux aberrants ou indésirables d'expression ou
5 d'activité de protéine Notch peuvent être diagnostiqués
par la détection de ces niveaux comme on le décrit plus
complètement ci-dessous.
Un produit thérapeutique est une protéine
consistant en au moins un fragment (nommé ici "fragment
10 adhésif") des protéines codées par des gènes
toporythmiques qui induit la liaison aux protéines
Notch ou à leurs fragments adhésifs. Les gènes
toporythmiques tels qu'ils sont utilisés ici
désigneront les gènes Notch, Delta et Serrate ainsi que
15 tous les autres membres de la famille Delta/Serrate qui
peuvent être identifiés grâce à une homologie de
séquence ou une interaction génétique et en général,
les membres de la "cascade Notch" ou du "groupe Notch"
de gènes qui sont identifiés par interactions
20 moléculaires (par exemple, liaison in vitro) ou des
interactions génétiques (détectées au niveau du
phénotype, par exemple chez Drosophila).
Dans un autre aspect, la description concerne des
protéines Notch humaines ; en particulier, qui sont
25 codées par l'homologue hN et des protéines comprenant
le domaine extracellulaire de la protéine et leurs
subséquences. Les acides nucléiques codant pour les
protéines précédentes et des cellules recombinantes
sont également proposés.
30
3.1. DEFINITIONS
Tels qu'ils sont utilisés ici, les termes suivants
auront les significations indiquées :
AA = acide aminé
EGF = facteur de croissance épidermique
5 ELR = répétition (homologue) de type EGF
IC = intracellulaire
PCR = réaction en chaîne polymerase
Tel qu'il est utilisé ici, le soulignement du nom
d'un gène désignera le gène, contrairement au produit
10 protéique codé qui est indiqué par le nom du gène en
l'absence de soulignement. Par exemple, "Notch"
désignera le gène Notch alors que "Notch" désignera le
produit protéique du gène Notch.
15 RESUME DE L'INVENTION
La présente invention propose une composition
pharmaceutique comprenant un vecteur acceptable sur le
plan pharmaceutique et une quantité efficace sur le
plan thérapeutique d'un anticorps anti protéine Serrate
20 selon la définition de la revendication 1.
Dans un mode de réalisation, l'anticorps est
polyclonal. Dans un autre mode de réalisation,
l'anticorps est monoclonal. Dans un autre mode de
réalisation de l'invention, l'anticorps concerne un
25 domaine de la protéine Serrate qui se lie à Notch. Ces
modes de réalisation sont définis dans les
revendications 2 à 4.
L'invention propose également une composition
pharmaceutique comprenant un vecteur acceptable sur le
3 0 plan pharmaceutique et une quantité efficace sur le
plan thérapeutique d'un fragment d'un anticorps anti
10
protéine Serrate, ledit fragment contenant le domaine
de liaison de l'anticorps, ledit anticorps étant tel
que défini dans l'une des revendications 1 à 4.
L'invention concerne en outre une composition
5 pharmaceutique comprenant un vecteur acceptable sur le
plan pharmaceutique et une quantité efficace sur le
plan thérapeutique d'un acide nucléique antisens de
Serrate.
De préférence, l'anticorps, le fragment
10 d'anticorps ou l'acide nucléique antisens,
respectivement, est purifié.
L'invention concerne en outre un anticorps tel que
défini dans l'une des revendications 1 à 4 et 7, un
fragment d'un anticorps tel que défini dans la
15 revendication 5 ou la revendication 7 ou un acide
nucléique antisens tel que défini dans la revendication
6 ou la revendication 7, destiné à être utilisé comme
médicament.
L'invention propose en outre l'utilisation d'un
20 anticorps tel que défini dans l'une des revendications
1 à 4 et 7, un fragment d'un anticorps tel que défini
dans la revendication 5 ou la revendication 7 ou un
acide nucléique antisens tel que défini dans la
revendications 6 ou la revendication 7, pour la
25 production d'un médicament pour traiter ou prévenir une
affection maligne chez un sujet.
11
4. DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1. Séquence de nucleotide primaire d'ADNc
DU de Delta (SEQ ID N° : 1) et séquence d'acides
aminés Delta (SES ID N° : 2) . La séquence ADN du brin
5 5'-3' de l'ADNc DU est présentée, contenant un certain
nombre de corrections par rapport à celle présentée par
Kopczynkski et coll. (1988, Genes Dev. 2 : 1723-1735).
Figure 2. Constructions d'expression de Notch et
cartographie de deletion du domaine de liaison de
10 Delta/Serrate. Des cellules S2 en phase de croissance
logarithmique ont été transfectées provisoirement avec
les séries de constructions d'expression présentées ;
les dessins représentent les produits de protéine
prévus des divers mutants de deletion de Notch créés.
15 Toutes les constructions d'expression étaient dérivées
de la construction #1 pMtNMg. Les cellules transfectées
de façon provisoires ont été mélangées avec des
cellules exprimant Delta à partir de la lignée
transformée de façon stable L49-6-7 ou avec des
20 cellules exprimant Serrate transfectées provisoirement,
induites avec CuS04, incubées dans des conditions
d'agrégation puis leur capacité à s'agréger a été
évaluée en utilisant des antiserums spécifiques et la
microscopie par immunofluorescence. Des agrégats ont
25 été définis en tant qu'amas de quatre cellules ou plus
contenant des cellules exprimant à la fois Notch et
Delta/Serrate. Les valeurs données pour le %
d'agrégation font référence au pourcentage de toutes
les cellules exprimant Notch trouvées dans ces amas
30 avec Delta (colonne de gauche) ou avec Serrate (Ser)
(colonne de droite). Les diverses constructions de
12
deletion de Notch sont représentées schématiquement
avec les lignes d'épissage indiquant les jonctions de
ligature. Chaque répétition EGF est marquée par un
carré rectangulaire en pointillés et les nombres de
5 répétition d'EGF de chaque côté d'une jonction de
ligature sont notés. Au niveau des jonctions de
ligature, les répétitions d'EGF partielles produites
par les diverses deletions sont marquées par des carrés
blancs et des parenthèses (voir par exemple #23
10 ACla+EGF(10-12)). Les constructions #3-13 représentent
les séries de deletion Clal. Comme cela est représenté,
quatre des sites Clal, dans les répétitions 7, 9, 17 et
26, rompent la répétition dans le milieu, immédiatement
après la troisième cysteine (marquée par des
15 encadrements blancs répétés ; voir figure 3 pour plus
de précision) alors que le cinquième site et le plus en
3' rompt nettement entre les répétitions 30 et 31 d'EGF
(marqué par la répétition d'encadrement blanc 31 ; là
encore, voir la figure 3) . Dans la division #15 de la
20 construction, la répétition EGF 14 qui porte la
mutation ponctuelle split est représentée sous la forme
d'un encadré hachuré. Dans la construction #33
ÀCla+XEGF(10-13), les répétitions d'EGF dérivées de
Notch de Xenopus se distinguent des répétitions de
25 Drosophila par un type différent de nuance. Sp, peptide
de signal ; EGF, répétition du facteur de croissance
épidermique ; N, répétition Notch/lin-12 ; TM, domaine
transmembranaire ; cdc 10, répétitions cdclO/ankyrin ;
PA, séquence consensus de liaison de nucleotide
30 putative ; opa, allongement de polyglutamine nommé opa ;
Dl, Delta ; Ser, Serrate.
13
Figure 3. Structure détaillée des constructions de
deletion de Notch #19-24 : les deux répétitions 11 et
12 d'EGF sont nécessaires pour l'agrégation Notch-Delta.
Les répétitions d'EGF 10-13 sont représentées dans le
5 haut, montrant l'espace normal des six résidus de
cysteine (C) . Les produits de PCR générés pour ces
constructions (noms et numéros indiqués sur la figure 2)
sont représentés par les lignes noires épaisses et les
points terminaux exacts sont notés par rapport aux
10 diverses répétitions d'EGF. La capacité à s'agréger
avec Delta est enregistrée en indiquant (+) ou (-) pour
chaque construction. Les fragments de PCR rompent les
répétitions d'EGF au milieu, juste après la troisième
cysteine au même endroit que quatre sites Clal sur cinq
15 ou exactement entre deux répétitions à la même place
que le site Clal le plus C-terminal.
Figure 4. Comparaison de la séquence d'acides
aminés des répétitions d'EGF 11 et 12 de Notch de
Drosophila et Xenopus. La séquence d'acides aminés des
20 répétitions d'EGF 11 et 12 de Notch de Drosophila (SEQ
ID N° : 14) (Wharton et coll., 1985, Cell 43 : 567-581 ;
Kidd et coll., 1986. Mol. Cell Biol. 6 : 3094-3108) est
alignée avec celle des deux mêmes répétitions d'EGF de
Notch de Xenopus (SEQ ID N° : 15) (Coffman et coll.,
25 1990, Science 249 : 1438-1441). Les acides aminés
identiques sont encadrés. Les six résidus de cysteine
conservés de chaque répétition d'EGF et les résidus
consensus de liaison de Ca++ (Rees et coll., 1988, EMBO
J. 7 : 2053-2061) sont marqués par un astérisque (*) .
3 0 Le changement de leucine en proline observé dans le
14
clone de PCR de Xenopus qui ne s'agrège pas est marqué
en dessous.
Figure 5. Homologies de séquence d'acide nucléique
entre Serrate et Delta. Une partie de la séquence de
5 nucleotide Serrate de Drosophila (SEQ ID N° : 3) , la
séquence de protéine Serrate codée (SEQ ID N° : 4)
étant notée en dessous (Fleming et coll. genes & Dev.
4 : 2188-2201 à 2193-94) est présentée. Les quatre
régions présentant une homologie de séquence élevée
10 avec la séquence Delta de Drosophila sont numérotées
au-dessus de la ligne et indiquées par des parenthèses.
La région d'homologie totale couvre les nucleotides
numéros 627 à 1290 de la séquence de nucleotides de
Serrate (en numérotant comme sur la figure 4 de Fleming
15 et coll., 1990, Genes & Dev, 4 : 2188-2201).
Figure 6. Diagramme schématique de clones de Notch
humains. Un diagramme schématique de Notch humain est
présenté. Les lignes en gras sous le diagramme montrent
la partie de la séquence Notch contenue dans les quatre
20 clones d'ADNc. L'emplacement des amorces utilisées dans
la PCR et leur orientation sont indiqués par des
flèches.
Figue 7. Séquences Notch humaines alignées avec la
séquence Notch de Drosophila. Les lignes verticales
25 numérotées correspondent aux coordonnées de Notch de
Drosophila. Les lignes horizontales sous chaque carte
montrent où se situent les clones par rapport aux
allongements de séquence (traits horizontaux épais).
Figure 8. Séquences de nucleotides Notch humain
3 0 contenus dans le clone hN2k d'ADNc de plasmide. Figure
8A : la séquence ADN (SEQ ID N° 5) d'une partie de
15
l'insert de Notch humain est présentée, en commençant
au niveau du site EcoRI à l'extrémité 3' et en allant
dans le sens 3' à 5'. Figure 8B : la séquence ADN (SEQ
ID N° : 6) d'une partie de l'insert Notch humain est
5 représentée, en commençant au niveau du site EcoRI à
l'extrémité 5' et en allant dans le sens 5' à 3'.
Figure 8C : la séquence ADN (SEQ ID N° : 7) d'une
partie de l'insert Notch humain est présentée, en
commençant au niveau 3' de la séquence présentée sur la
10 figure 8B et en allant dans le sens 5 ' à 3 ' . Les
séquences présentées sont provisoires, à confirmer par
la détermination des séquences chevauchantes.
Figure 9. Séquences de nucleotides de Notch humain
contenues dans un clone hN4k d'ADNc de plasmide. Figure
15 9A : la séquence d'ADN (SEQ ID N° : 8) d'une partie de
l'insert de Notch humain est présentée, en commençant
au niveau du site EcoRI à l'extrémité 5' et en allant
dans le sens 5' à 3'. Figure 9B : la séquence ADN (SEQ
ID N° : 9) d'une partie de l'insert de Notch humain est
20 présentée, en commençant à proximité de l'extrémité 3'
et en allant dans le sens 3' à 5' . Les séquences
présentées sont provisoires, doivent être confirmées
par la détermination des séquences chevauchantes.
Figure 10. Séquences d'ADN (SEQ ID N° 10) et
25 d'acides aminés (SEQ ID N° : 11) de Notch humain
contenu dans le clone hN3k d'ADNc de plasmide.
Figure 11. Séquences ADN (SEQ ID N° : 12) et
d'acides aminés (SEQ ID N° : 13) de Notch humain
contenu dans le clone hN5k d'ADNc de plasmide.
3 0 Figure 12. Comparaison de hN5k avec d'autres
homologues de Notch. Figure 12A. Représentation
16
schématique de Notch de Drosophila. La séquence de
signal (signal) , les 36 répétitions de type EGF, les
trois répétitions Notch/lin-12, le domaine
transmembranaire (TM), les six répétitions CDC10, la
5 répétition OPA et la région riche en PEST (proline,
acide glutamique, serine, threonine) sont présentés.
Figure 12B. Alignement de la séquence d'acides aminés
déduite de hN5k avec les séquences d'autres homologues
Notch. Les acides aminés sont numérotés du côté gauche.
10 Les régions cdc 10 et riches en PEST sont toutes deux
encadrées et les répétitions cdclO individuelles sont
marquées. Les acides aminés qui sont identiques dans
trois séquences ou plus sont soulignées. Les amorces
utilisées pour cloner hN5k sont indiquées sous les
15 séquences à partir desquelles elles sont conçues. La
séquence de localisation nucléaire (NLS), les sites de
caséine kinase II (CKII) et de cdc2 kinase (cdc2) du
motif CcN putatif des homologues Notch de vertébrés
sont encadrés. La séquence cible nucléaire bipartite
20 possible (BNTS) et les sites de phosphorylation
proximaux de Notch de Drosophila sont également
encadrés.
Figure 13. Séquences d'acides aminés alignées des
protéines Notch de diverses espèces. humN : protéine
25 Notch humaine codée par l'homologue hN (contenu en
partie dans le plasmide hN5k) (SEQ ID N° : 19). TAN-1 :
la protéine Notch humaine codée par l'homologue TAN-1
(SEQ ID N° : 20) (la séquence présentée est dérivée en
partie de nos travaux et en partie de la séquence de
30 TAN-1 publiée par Ellisen et coll., 1991, Cell 66 :
649-661) ; Xen N : protéine Notch de Xenopus (Coffman
17
et coll., 1990, Science 249 : 1438-1441). Dros N :
protéine Notch de Drosophila (Wharton et coll., 1985,
Cell 43 : 567-581). Les domaines structuraux sont
indiqués.
5 Figure 14. Coloration immunocytochimique de tissus
de cancer du sein d'une patiente humaine. Les tissus
mammaires malins dans un échantillon obtenu d'un
patient humain ont été englobés dans une section de
paraffine et soumis à une coloration immunocytochimique
10 avec l'anticorps monoclonal P4 de Notch anti-humain,
dirigé contre la protéine TAN-1. Les tissus mammaires
non malins présentaient une coloration beaucoup moins
importante (non représenté).
Figure 15. Coloration immunocytochimique de tissus
15 du côlon d'un patient humain souffrant d'un cancer du
côlon. Un échantillon de tissu du côlon obtenu d'un
patient souffrant du cancer du côlon a été englobé dans
une section de paraffine et soumis à une coloration
immunocytochimique avec l'anticorps monoclonal PI de
20 Notch anti-humain, dirigé contre la protéine codée par
hN. Les zones de coloration accrue sont les zones dans
lesquelles les cellules malignes sont présentes comme
cela est déterminé par la morphologie cellulaire.
Figure 16. Coloration immunocytochimique de tissu
25 cervical. Des échantillons de tissus humains ont été
obtenus, contenant des cellules cancéreuses du col de
l'utérus (fig. 16A) ou d'epithelium cervical normal
(Fig. 16B) de la même patiente, englobés dans une
section de paraffine et soumis à une coloration
30 immunocytochimique avec un anticorps monoclonal de
Notch anti-humain dirigé contre la protéine TAN-1. Les
18
zones contenant des cellules malignes (déterminées par
la morphologie) présentaient une coloration accrue par
rapport aux cellules non malignes. Parmi les cellules
non malignes, on trouve les tissus conjonctifs et la
5 couche basale de 1'epithelium (contenant les cellules
souches) colorées avec l'anticorps anti-Notch.
Figure 17. ADN (SEQ ID N° : 21) et séquence
d'acides aminés codées (contenue dans SEQ ID N° : 19)
de 1'homologue hN de Notch humain. La séquence codante
10 d'ADN entière est présentée (ainsi qu'une séquence non
codante), à l'exclusion de celle codant pour
l'initiateur Met. Les 8 derniers nucleotides présentés
(numéros 9716-9723) sont des vecteurs et non hN, des
séquences.
15
DESCRIPTION DETAILLEE
La description suivante fournit des informations
pertinentes pour la présente invention. Toutefois,
seules les parties de la description dans lesquelles on
20 fait référence à l'invention concernent les sujets pris
en compte par les présentes revendications.
La présente description concerne des procédés
thérapeutiques et diagnostiques et des compositions à
base de protéines et acides nucléiques de Notch. La
25 description concerne le traitement de perturbations de
la destinée ou de la différenciation cellulaire par
l'administration d'un composé thérapeutique de
l'invention. Ces composés thérapeutiques (nommés ici
"produits thérapeutiques") comprennent les protéines
30 Notch, leurs analogues et dérivés (comprenant les
fragments) ; les anticorps contre celles-ci, les acides
19
nucléiques codant pour les protéines Notch, dérivés ou
analogues, les acides nucléiques antisens Notch et les
protéines toporythmiques et leurs dérivés et analogues
qui se lient aux protéines Notch ou interagissent d'une
5 autre façon avec celles-ci, et leurs acides nucléiques
et anticorps codants. Des protéines et dérivés et
analogues de celles-ci qui sont capables d'inhiber les
interactions d'une protéine Notch avec une autre
protéine toporythmique (par exemple, Delta, Serrate)
10 sont également proposés. Dans ce qui suit, les
anticorps, fragments d'anticorps et acides nucléiques
antisens pris en compte par les présentes
revendications sont nommés "produits thérapeutiques de
l'invention". Un produit thérapeutique de l'invention
15 est administré pour traiter une pathologie cancéreuse
ou pour prévenir la progression d'un état pré-
néoplasique ou non malin (par exemple, une affection
métaplasique) en un état néoplasique ou malin. Un
produit thérapeutique peut être administré pour traiter
20 un trouble du système nerveux tel qu'une lésion des
nerfs ou une maladie degenerative. Un produit
thérapeutique peut être administré pour favoriser la
régénérescence et la réparation tissulaire pour le
traitement de diverses maladies.
25 Les produits thérapeutiques qui antagonisent ou
inhibent la fonction Notch (désignés ci-après "produits
thérapeutiques antagonistes") sont administrés pour
obtenir un effet thérapeutique ; les troubles qui
peuvent ainsi être traités peuvent être identifiés par
30 des essais in vitro tels que ceux décrits au paragraphe
5.1, ci-dessous. Ces produits thérapeutiques
20
antagonistes comprennent, de manière non restrictive,
des acides nucléiques antisens de Notch, les anticorps
neutralisants anti-Notch, les inhibiteurs compétitifs
des interactions protéine-protéine de Notch (par
5 exemple, une protéine comprenant ELR-11 et ELR-12 de
Notch) et des molécules qui interfèrent avec une
fonction intracellulaire de Notch telles que celle
induite par les répétitions cdclO comme on le décrit en
détail ci-dessous.
10 Les produits thérapeutiques qui favorisent la
fonction Notch (désignés ci-après "produits
thérapeutiques antagonistes") sont administrés pour
obtenir un effet thérapeutique ; les troubles qui
peuvent ainsi être traités peuvent être identifiés par
15 des essais in vitro tels que ceux décrits au paragraphe
5.1, ci-dessous. Ces produits thérapeutiques
antagonistes comprennent, de façon non restrictive, les
protéines Notch et leurs dérivés comprenant le domaine
intracellulaire, les acides nucléiques Notch codant
20 pour les précédentes (par exemple, une protéine
comprenant un domaine extracellulaire d'une protéine
Delta ou d'une séquence Delta homologue aux acides
aminés 1-230 Delta de Drosophila (voir figure 1 et SEQ
ID N° : 2) ou comprenant une séquence Serrate homologue
25 aux acides aminés 79-282 Serrate de Drosophila (voir
figure 5 et SEQ ID N° : 4) ) .
Les perturbations de la destinée cellulaire, en
particulier les états précancéreux tels que les
métaplasies et les dysplasies et les troubles
3 0 hyperprolifératifs (par exemple le cancer) ou
hypoprolifératifs comprenant des niveaux aberrants ou
21
indésirables d'expression ou d'activité de protéine
Notch peuvent être diagnostiqués par la détection de
ces niveaux comme on le décrit plus complètement ci-
dessous.
5 Un produit thérapeutique est une protéine
consistant en au moins un fragment (nommé ici "fragment
adhésif") des protéines codées par des gènes
toporythmiques qui induit la liaison aux protéines
Notch ou à leurs fragments adhésifs. Les gènes
10 toporythmiques tels qu'ils sont utilisés ici
désigneront les gènes Notch, Delta et Serrate ainsi que
tous les autres membres de la famille Delta/Serrate qui
peuvent être identifiés grâce à une homologie de
séquence ou une interaction génétique et en général,
15 les membres de la "cascade Notch" ou du "groupe Notch"
de gènes qui sont identifiés par interactions
moléculaires (par exemple, liaison in vitro) ou des
interactions génétiques (détectées au niveau du
phénotype, par exemple chez Drosophila).
20 La description concerne en outre une protéine
Notch humaine codée par l'homologue hN et des protéines
comprenant le domaine extracellulaire de la protéine et
leurs subséquences. Les acides nucléiques codant pour
les protéines précédentes et des cellules recombinantes
25 sont également proposés.
Pour plus de clarté de la description et de
manière non restrictive, la description détaillée de
l'invention est divisée en sous-sections suivantes :
(i) utilisations thérapeutiques ;
30 (ii) utilisations prophylactiques ;
22
(iii) démonstration de l'utilité thérapeutique ou
prophylactique ;
(iv) administration et compositions
thérapeutiques/prophylactiques ;
5 (v) régulation antisens de l'expression de Notch ;
(vi) utilité diagnostique ;
(vii) acides nucléiques de Notch ;
(viii) production recombinante de produits
thérapeutiques protéiques ;
10 (ix) dérivés et analogues de Notch et autres
protéines toporythmiques ;
(x) dosages des protéines Notch, dérivés et
analogues ; et
(xi) anticorps anti-protéines Notch, dérivés et
15 analogues.
5.1. UTILISATIONS THERAPEUTIQUES
Comme indiqué ci-dessus, les produits
thérapeutiques antagonistes sont les produits
20 thérapeutiques qui antagonisent ou inhibent une
fonction Notch. Ces produits thérapeutiques
antagonistes sont identifiés de façon tout
particulièrement préférée par l'utilisation d'essais in
vitro pratiques connus, par exemple basés sur leur
25 capacité à inhiber la liaison de Notch à d'autres
protéines (voir paragraphes 6 à 8 du présent document)
ou inhibent une fonction Notch connue dosée in vitro,
bien que les essais génétiques (par exemple chez
Drosophila) puissent également être utilisés. Dans un
3 0 aspect préféré, le produit thérapeutique antagoniste
est une protéine ou un dérivé de celle-ci, comprenant
23
un fragment fonctionnellement actif tel qu'un fragment
adhésif de Notch. Dans des aspects spécifiques, ce
produit thérapeutique antagoniste peut être les
protéines adhésives codées par les constructions
5 appropriées décrites aux paragraphes 6 et 7, ci-dessous,
ou les protéines comprenant la région extracellulaire
de Notch, en particulier, ELR-11 et ELR-12 ou un
anticorps contre celles-ci ou un analogue/inhibiteur
compétitif d'une région de transduction de signal
10 intracellulaire, un acide nucléique capable d'exprimer
un fragment adhésif de Notch ou un acide nucléique
antisens de Notch (voir le paragraphe 5.5 du présent
document) . Il convient de noter que dans certains cas,
un fragment adhésif de Notch (ou éventuellement
15 d'autres produits thérapeutiques antagonistes présumés)
peut agir en variante en tant que produit thérapeutique
agoniste en fonction de l'historique de développement
du tissu qui est exposé au produit thérapeutique ; de
préférence, des essais in vitro ou in vivo appropriés
20 tels que décrits ci-dessous, doivent être utilisés pour
déterminer l'effet d'un produit thérapeutique
spécifique et pour savoir si son administration est
indiquée pour le traitement du tissu affecté.
Dans un autre aspect de la description, un acide
25 nucléique codant pour une partie d'un gène Notch est
utilisé comme produit thérapeutique antagoniste, pour
favoriser 1'inactivation de Notch par recombinaison
homologue (Koller et Smithies, 1989. Proc. Natl. Acad.
Sei. USA 86 : 8932-8935 : Ziistra et coll., 1989,
30 Nature 342-435-438).
24
Les produits thérapeutiques agonistes tels que
décrits ci-dessus favorisent la fonction Notch. Ces
produits thérapeutiques agonistes comprennent, de
manière non restrictive, les protéines et dérivés
5 comprenant les parties des protéines toporythmiques
telles que Delta ou Serrate qui induisent la liaison à
Notch et les acides nucléiques codant pour les
précédentes (qui peuvent être administrés pour exprimer
leurs produits codés in vivo) . Dans un aspect
10 spécifique, cette partie de Delta est constituée par
les acides aminés 1-230 Delta de D. melanogaster (SEQ
ID N° : 1) ou une partie de Delta humain le plus
homologue de ceux-ci. Dans un autre aspect spécifique,
la partie de Serrate est constituée par les acides
15 aminés 79-282 Serrate de D. melanogaster (SEQ ID N° : 5)
ou une partie de Serrate humain la plus homologue de
ceux-ci. Dans d'autres aspects spécifiques, cette
partie de Delta ou de Serrate est la partie
extracellulaire de cette protéine.
20 D'autres descriptions et, sources de produits
thérapeutiques de la description sont présentées aux
paragraphes 5.4 à 5.8 du présent document.
Les produits thérapeutiques agonistes et
antagonistes ont une utilité thérapeutique pour les
25 perturbations de la destinée cellulaire. Les produits
thérapeutiques agonistes sont administrés
thérapeutiquement (y compris de façon prophylactique) :
(1) dans les maladies ou les troubles comprenant une
absence ou une diminution (relative à normale ou
30 souhaitée) des niveaux de la fonction Notch, par
exemple chez les patients chez lesquels la protéine
25
Notch est absente, génétiquement defective,
biologiquement inactive ou insuffisamment active ou
sous-exprimée et (2) dans les maladies ou troubles dans
lesquels les dosages in vitro (ou in vivo) (voir ci-
5 dessous) indiquent l'utilité de l'administration d'un
agoniste de Notch. L'absence ou la diminution des taux
de la fonction Notch peuvent être détectées facilement,
par exemple en obtenant un échantillon de tissu d'un
patient (par exemple à partir d'un tissu de biopsie) et
10 en dosant in vitro les taux de protéine, la structure
et/ou l'activité de la protéine Notch exprimée. De
nombreux procédés standard dans 1'art peuvent donc être
utilisés comprenant, de manière non restrictive, des
essais immunologiques permettant de détecter et/ou de
15 visualiser la protéine Notch (par exemple, Western blot,
immunoprécipitation suivie d'une électrophorèse sur gel
de dodécyl-sulfate de sodium - Polyacrylamide,
immunocytochimie, etc., voir également les essais
énumérés au paragraphe 5.6 ci-dessous) et/ou des essais
20 d'hybridation pour détecter l'expression de Notch en
détectant et/ou visualisant l'ARNm de Notch (par
exemple, essais Northern, dot blots, hybridation in
situ, etc.).
Les essais in vitro qui peuvent être utilisés pour
25 déterminer si l'administration d'un produit
thérapeutique agoniste ou antagoniste spécifique est
indiquée comprennent les essais de culture cellulaire
in vitro dans lesquels l'échantillon de tissu d'un
patient est développé en culture et exposé ou
30 administré d'une autre façon à un produit thérapeutique
et l'effet de ce produit thérapeutique sur
26
l'échantillon de tissu est observé. Dans un aspect, si
le patient présente une affection maligne, un
échantillon de cellules de cette affection maligne est
étalé ou cultivé en culture et les cellules sont
5 ensuite exposées à un produit thérapeutique. Un produit
thérapeutique qui inhibe la survie ou la croissance des
cellules malignes (par exemple en favorisant la
différenciation terminale) est choisi pour
l'utilisation thérapeutique in vivo. De nombreux essais
10 standard dans l'art peuvent être utilisés pour évaluer
la survie et/ou la croissance ; par exemple, la
prolifération cellulaire peut être testée par mesure de
l'incorporation de 3H-thymidine, par dénombrement
cellulaire direct, par détection des changements de
15 l'activité transcriptionnelle de gènes connus tels que
les proto-oncogènes (par exemple fos, myc) ou les
marqueurs du cycle cellulaire ; la viabilité des
cellules peut être évaluée par coloration au bleu de
trypan, la différenciation peut être évaluée
2 0 visuellement sur la base de changements de morphologie,
etc. Dans un aspect spécifique, les cultures de
cellules malignes sont exposées séparément à (1) un
produit thérapeutique agoniste et (2) un produit
thérapeutique antagoniste ; le résultat de l'essai
25 pouvant indiquer le type de produit thérapeutique qui a
une efficacité thérapeutique.
Dans un autre aspect, un produit thérapeutique est
indiqué pour l'utilisation qui présente l'effet
souhaité, l'inhibition ou la stimulation de la
30 croissance cellulaire sur un échantillon cellulaire
d'un patient à partir d'un tissu présentant ou suspecté
27
de présenter des troubles hyper- ou hypoprolifératifs,
respectivement. Ces troubles hyper- ou
hypoprolifératifs comprennent, de manière non
restrictive, ceux décrits aux paragraphes 5.1.1 à 5.1.3
5 ci-dessous.
Dans un autre aspect spécifique, un produit
thérapeutique est indiqué pour l'utilisation dans le
traitement des lésions nerveuses ou d'un trouble
dégénératif du système nerveux (voir le paragraphe
10 5.1.2) qui présente une stimulation in vitro de la
régénérescence nerveuse/extension des neurites à partir
des cellules nerveuses du type de patient affecté.
De plus, l'administration d'un produit
thérapeutique antagoniste est également indiquée dans
15 les maladies ou les troubles déterminés öu connus pour
impliquer un phénotype activé dominant de Notch
(mutations de "gain de fonction"). L'administration
d'un produit thérapeutique agoniste est indiquée dans
les maladies ou les troubles déterminés ou connus pour
20 impliquer un phénotype négatif dominant de Notch
(mutations "perte de fonction"). Nous avons étudié les
fonctions de divers domaines structuraux de la protéine
Notch in vivo en exprimant au niveau ectopique, une
série de mutants de deletion de Notch de Drosophila
25 sous le promoteur de choc thermique hsp70 ainsi que des
promoteurs spécifiques de l'?il. Deux classes de
phénotypes dominants sont observées, l'une suggérant
des mutations de perte de fonction de Notch et l'autre,
des mutations de gain de fonction de Notch. Les
3 0 phénotypes "activés" dominants résultaient de la
surexpression d'une protéine dépourvue des séquences
28
les plus extracellulaires alors que les phénotypes
"négatifs" dominants résultaient de la surexpression
d'une protéine dépourvue de la plupart des séquences
intracellulaires. Nos résultats indiquent que Notch
5 fonctionne comme un récepteur dont le domaine
extracellulaire induit une liaison au ligand,
entraînant la transmission de signaux de développement
par le domaine cytopiasmique. Les phénotypes observés
ont également suggéré que la région de répétition
10 cdclO/ankyrine dans le domaine intracellulaire joue un
rôle essentiel dans les événements de transduction de
signal induits par Notch (fonction intracellulaire).
Dans divers aspects spécifiques, des essais in
vitro peuvent être réalisés avec des cellules
15 représentatives de types cellulaires impliqués dans les
troubles d'un patient, pour déterminer si un produit
thérapeutique a un effet souhaité sur ces types de
cellules.
Dans un autre aspect, les cellules d'un
20 échantillon tissulaire d'un patient suspecté d'être
pré-néoplasique sont étalées de la même façon ou
cultivées in vitro et exposées à un produit
thérapeutique. Le produit thérapeutique qui donne un
phénotype cellulaire qui est plus normal (c'est-à-dire
25 moins représentatif d'un état pré-néoplasique, d'un
état néoplasique, d'un état malin ou d'un phénotype
transformé) est choisi pour une utilisation
thérapeutique. De nombreux essais standard dans l'art
peuvent être utilisés pour évaluer si un état
3 0 prénéoplasique, un état néoplasique ou un phénotype
transformé ou malin est présent (voir paragraphe 5.2.1).
29
Par exemple, les caractéristiques associées à un
phénotype transformé (un groupe de caractéristiques in
vitro associées à une capacité tumorigène in vivo)
comprennent une morphologie cellulaire plus arrondie,
5 une liaison plus lâche au substrat, une perte de
l'inhibition de contact, une perte de la dépendance
d'ancrage, une libération de proteases telles que
l'activateur du plasminogène, une augmentation du
transport du sucre, une diminution des besoins sériques,
10 une expression d'antigènes f?taux, la disparition de la
protéine de surface de 250 000 daltons, etc. (voir
Luria et coll., 1978, General Virology, 3eme éd., John
Wiley & Sons, New York pp. 436-446) .
Dans d'autres aspects spécifiques, les essais in
15 vitro décrits ci-dessus peuvent être réalisés en
utilisant une lignée cellulaire au lieu d'un
échantillon cellulaire dérivé du patient spécifique à
traiter, chez lequel la lignée cellulaire est dérivée
de ou présente des caractéristiques associées au
20 trouble malin, néoplasique ou prénéoplasique que l'on
souhaite traiter ou prévenir ou est dérivé de la
cellule neurale ou d'un autre type de cellule sur
laquelle/lequel un effet est souhaité.
Les produits thérapeutiques antagonistes sont
25 administrés thérapeutiquement (y compris en
prophylaxie) : (1) dans les maladies ou les troubles
comprenant une augmentation (relative à normale ou
souhaitée) des niveaux de la fonction Notch, par
exemple lorsque la protéine est surexprimée ou
3 0 excessivement active ; et (2) dans les maladies ou
troubles dans lesquels les dosages in vitro (ou in vivo)
10
30
indiquent l'utilité de l'administration d'un
antagoniste de Notch. Les niveaux accrus de la fonction
Notch peuvent être détectés facilement par des procédés
tels que ceux décrits ci-dessus, par la quantification
de la protéine et/ou de l'ARN. Les essais in vitro avec
les cellules de l'échantillon de tissu d'un patient ou
la lignée cellulaire ou le type cellulaire approprié(e)
pour déterminer l'utilité thérapeutique, peuvent être
réalisés comme on l'a décrit ci-dessus.
5.1.1 AFFECTIONS MALIGNES
Les affections malignes et prénéoplasiques qui
peuvent être utilisées comme on l'a décrit ci-dessus
pour l'efficacité de l'intervention avec des produits
15 thérapeutiques antagonistes ou agonistes et qui peuvent
être traitées en observant une indication de l'utilité
thérapeutique comprennent, de manière non restrictive,
celles décrites ci-dessous dans les paragraphes 5.1.1
et 5.2.1.
20 Les affections malignes et les troubles associés
dont le type de cellule peut être testé in vitro (et/ou
in vivo) et après observation du résultat de test
approprié, traité selon la présente invention,
comprennent de manière non restrictive, celles
25 énumérées dans le tableau 1 (pour une récapitulation de
ces troubles, voir Fishman et coll., 1985, Medicine,
2ème éd., J.B. Lippincott Co., Philadelphie).
31
TABLEAU 1
AFFECTIONS MALIGNES ET TROUBLES ASSOCIES
Leucémie
Leucémie aiguë
5 Leucémie lymphocytaire aiguë
Leucémie myélocytaire aiguë
myeloblastique
promyélocytaire
myélomonocytaire
10 monocytaire
érythroleucémie
Leucémie chronique
Leucémie (granulocytaire) myélocytaire
chronique
15 Leucémie lymphocytaire chronique
Polycythémie vraie
Lymphome
Maladie de Hodgkin
Lymphome non hodgkinien
20 Myélome multiple
Macroglobulinémie de Waldenstrom
Maladie des chaînes lourdes
Tumeurs solides
Sarcomes et carcinomes
25 Fibrosarcome
Myxosarcome
Liposarcome
Chondrosarcome
Sarcome ostéogénique
3 0 Chordome
Angiosarcome
32
Endothéliosarcome
Lymphangiosarcome
Lymphangio-endothé1iosarcome
Synoviome
5 Mesotheliome
Tumeur de Ewing
Leiomyocarcorne
Rhabdomyocarcome
Carcinome du côlon
10 Cancer du pancréas
Cancer du sein
Cancer des ovaires
Cancer de la prostate
Carcinome malpighien
15 Epitheliome baso-cellulaire
Adénocarcinome
Adénocarcinome sudoripare
Carcinome des glandes sébacées
Carcinome papillaire
20 Adénocarcinomes papillaires
Cystadénocarcinome
Carcinome médullaire
Carcinome bronchogène
Hyp e rnéphrorne
25 Hepatome
Carcinome des voies biliaires
Chorio-carcinome
Seminome
Carcinome embryonnaire
3 0 Tumeur de Wilm
Cancer du col de l'utérus
33
Cancer des testicules
Cancer du poumon
Carcinome pulmonaire à petites cellules
Carcinome de la vessie
5 Carcinome epithelial
Gliome
Astrocytome
Medulloblastome
Craniopharyngiome
10 Ependymome
Pinealome
Hémangioblastome
Neurinome de 1'acoustique
Oligodendrogliome
15 Ménangiome
Mélanome
Neuroblastome
Rétinoblastome
20 Dans des aspects spécifiques, les modifications
malignes ou dysprolifératives (telles que les
métaplasies et dysplasies) sont traitées ou prévenues
dans les tissus épithéliaux tels que ceux du col de
l'utérus, de l'?sophage et des poumons.
25 Comme cela est détaillé au paragraphe des exemples
10.1 ci-dessous, les affections malignes du sein, du
côlon et du col de l'utérus présentent une expression
accrue de Notch humain par rapport à ces tissus non
malins. Par conséquent, dans des aspects spécifiques,
3 0 les affections malignes du sein, du côlon ou du col de
l'utérus sont traitées ou empêchées par
34
l'administration d'une quantité efficace d'un produit
antagoniste de l'invention. La présence de l'expression
accrue de Notch dans le cancer du sein, du côlon et du
col de l'utérus suggère que dans un nombre beaucoup
5 plus important de maladies cancéreuses, on observe une
régulation positive de Notch. Par conséquent, nous
prévoyons que beaucoup plus de cancers, par exemple les
séminomes, mélanomes et cancer du poumon peuvent être
traités ou prévenus par l'administration d'un produit
10 thérapeutique antagoniste.
5.1.2 AFFECTIONS DU SYSTEME NERVEUX
Les troubles du système nerveux comprenant des
types de cellules qui peuvent être utilisés tels que
15 décrits ci-dessus pour l'efficacité de l'intervention
avec des produits thérapeutiques antagonistes ou
agonistes et qui peuvent être traités ainsi en
observant une indication d'utilité thérapeutique
comprennent, de manière non restrictive, les lésions du
20 système nerveux et les maladies ou troubles qui
résultent d'une déconnexion d'axones, par exemple, une
diminution ou un dégénérescence neuronale ou une
démyélinisation. Les lésions du système nerveux qui
peuvent être traitées chez un patient (comprenant les
25 patients mammifères humains et non humains) comprennent,
de manière non restrictive, les lésions suivantes du
système nerveux central (comprenant la moelle épinière,
le cerveau) ou périphérique :
(i) lésions traumatiques comprenant les lésions
3 0 provoquées par une lésion physique ou associées à une
intervention chirurgicale, par exemple, les lésions qui
35
coupent une partie du système nerveux ou des lésions de
compression ;
(ii) les lésions ischémiques dans lesquelles un
manque d'oxygène dans une partie du système nerveux
5 entraîne une lésion neuronale ou la mort, comprenant
l'infarctus cérébral ou l'ischémie, ou l'infarctus ou
ischémie de la moelle épinière ;
(iii) les lésions malignes dans lesquelles une
partie du système nerveux est détruite ou lésée par un
10 tissu malin qui est une lésion maligne associée au
système nerveux ou une lésion maligne dérivée d'un
tissu non nerveux ;
(iv) les lésions infectieuses dans lesquelles une
partie du système nerveux est détruite ou lésée en
15 conséquence d'une infection, par exemple par un abcès
ou associées à une infection par le virus de
1'immunodéficience humaine, le zona ou le virus herpes
simplex ou la maladie de Lyme, la tuberculose, la
syphilis ;
2 0 (v) les lésions dégénératives dans lesquelles une
partie du système nerveux est détruite ou lésée en
conséquence d'un processus dégénératif comprenant, de
manière non restrictive, la dégénérescence associée à
la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la
25 chorée de Huntington, ou la sclérose latérale
amyotrophique ;
(vi) les lésions associées à des maladies ou
troubles nutritionnels dans lesquels une partie du
système nerveux est détruite ou lésée par un trouble
3 0 nutritionnel ou un trouble du métabolisme comprenant,
de manière non restrictive, une carence en vitamine B12,
36
une carence en acide folique, la maladie de Wernicke,
amblyopie liée au tabac ou à l'alcool, la maladie de
Marchiafava-Bignami (dégénérescence primaire du corps
calleux) et la dégénérescence cérébelleuse alcoolique ;
5 (vii) les lésions neurologiques associées aux
maladies systémiques comprenant, de manière non
restrictive, le diabète (neuropathie diabétique,
paralysie de Bell), le lupus érythémateux systémique,
le carcinome ou la sarcoïdose ;
10 (viiij les lésions provoquées par les substances
toxiques comprenant l'alcool, le plomb ou des
neurotoxines particulières ; et
(ix) les lésions démyélinées dans lesquelles une
partie du système nerveux est détruite ou lésée par une
15 maladie démyélinisante comprenant, de manière non
restrictive, la sclérose en plaques, la myélopathie
associée au virus de 1'immunodéficience humaine, la
myélopathie transversale de diverses etiologies, la
leuco-encéphalopathie multifocale progressive et la
20 myélinolyse centro-pontine.
Les produits thérapeutiques qui sont utiles selon
l'invention pour le traitement d'un trouble du système
nerveux peuvent être choisis en testant 1'activité
biologique dans la promotion de la survie ou de la
25 différenciation des neurones (voir également le
paragraphe 5.1). Par exemple, et de manière non
restrictive, les produits thérapeutiques qui induisent
l'un des effets suivants peuvent être utiles
(i) temps de survie accru des neurones en
3 0 cultures ;
37
(ii) bourgeonnement accru des neurones en culture
ou in vivo ;
(iii) production accrue d'une molécule associée
aux neurones en culture ou in vivo, par exemple, la
5 choline acétyltransferase ou 1'acetylcholinesterase par
rapport aux neurones moteurs ; ou
(iv) diminution des symptômes de dysfonctionnement
neuronal in vivo. Ces effets peuvent être mesurés par
tout procédé connu dans l'art. Dans des aspects non
10 restrictifs préférés, la survie accrue des neurones
peut être mesurée par le procédé défini par Arakawa et
coll. (1990, J. Neurosci. 10 : 3507-3515) : le
bourgeonnement accru des neurones peut être détecté par
des procédés définis par Pestronk et coll. (1980, Exp.
15 Neurol. 70 : 65-82) ou Brown et coll. (1981, Ann. Rev.
Neurose. 4 : 17-42) ; l'augmentation de la production
de molécules associées aux neurones peut être mesurée
par un titrage biologique, un essai enzymatique, .une
liaison à un anticorps, un essai Northern blot, etc. en
20 fonction de la molécule à mesurer ; et le
dysfonctionnement des neurones moteurs peut être mesuré
en évaluant la manifestation physique des troubles des
neurones moteurs, par exemple, la faiblesse, la
vélocité de la conduction dans les neurones moteurs ou
25 une incapacité fonctionnelle.
Dans un aspect spécifique, les troubles des
neurones moteurs qui peuvent être traités selon
l'invention comprennent de manière non restrictive, les
troubles tels que l'infarctus, l'infection,
3 0 l'exposition à des toxines, les traumatismes, les
lésions chirurgicales, les maladies dégénératives ou
38
malignes qui peuvent affecter les neurones moteurs
ainsi que d'autres composants du système nerveux ainsi
que les troubles qui affectent sélectivement les
neurones tels que la sclérose latérale amyotrophique et
5 comprenant, de manière non restrictive, l'atrophie
musculaire spinale progressive, la paralysie bulbaire
progressive, la sclérose latérale primaire, l'atrophie
infantile et juvénile, la paralysie bulbaire
progressive de l'enfance (syndrome de Fazio-Londe), la
10 poliomyélite et le syndrome post-polio et la
neuropathie sensitivo-motrice héréditaire (maladie de
Charcot-Marie-Tooth).
5.1.3 REPARATION ET REGENERESCENCE TISSULAIRE
15 Un produit thérapeutique de 1'invention est
utilisé pour favoriser la régénérescence et la
réparation tissulaire, comprenant, de manière non
restrictive, le traitement des troubles
dysprolifératifs bénins. Les aspects spécifiques
20 concernent le traitement de la cirrhose du foie (un
état dans lequel la cicatrisation a pris le pas sur les
processus de régénérescence normaux du foie), le
traitement de la formation de chéloïde (cicatrice
hypertrophique) (défigurant la peau sur laquelle le
25 processus de cicatrisation interfère avec le
renouvellement normal), le psoriasis (une affection
cutanée courante caractérisée par la prolifération
excessive de la peau et un retard dans la détermination
appropriée de la destinée cellulaire) et la calvitie
30 (un état dans lequel les follicules pileux différenciés
39
au niveau terminal (un tissu riche en Notch) ne
fonctionnent pas correctement).
5.2 UTILISATIONS PROPHYLACTIQUES
5 5.2.1 AFFECTIONS MALIGNES
Les produits thérapeutiques de 1'invention peuvent
être administrés pour prévenir la progression en état
néoplasique ou malin, comprenant, de manière non
restrictive, les troubles énumérés dans le tableau 1.
10 Cette administration est indiquée dans les cas indiqués
dans les essais pour le produit thérapeutique comme on
le décrit ci-dessous, pour servir au traitement ou à la
prévention de ce trouble. Cette utilisation
prophylactique est indiquée dans les états connus ou
15 suspectés de précéder une progression en néoplasie ou
cancer, en particulier dans les cas où la croissance de
cellules non néoplasiques comprenant 1'hyperpiasie, la
métaplasie ou plus particulièrement, la dysplasie, est
survenue (pour un tour d'horizon de ces états de
20 croissance anormaux, voir Robbins et Angell, 1976,
Basic Pathology, 2ème éd. W.B. Saunders Co.,
Philadelphia, pp. 68-79). L'hyperplasie est une forme
de prolifération cellulaire contrôlée comprenant une
augmentation du nombre de cellules dans un tissu ou un
25 organe, sans altération significative de structure ou
de fonction. A titre d'exemple, 1'hyperplasie de
1'endomètre précède souvent un cancer de 1'endomètre.
Une métaplasie est une forme de croissance cellulaire
contrôlée, dans laquelle un type de cellules adultes ou
30 complètement différenciées se substitue à un autre type
de cellules adultes. Les métaplasies peuvent se
40
produire dans les cellules de tissus épithéliaux ou
conjonctifs. Les métaplasies atypiques comprennent un
epithelium métaplasique relativement perturbé. La
dysplasie est fréquemment un précurseur du cancer et on
5 la trouve principalement dans 1'epithelium ; c'est la
forme la plus anormale de croissance cellulaire non
néoplasique, impliquant une perte de l'uniformité
cellulaire individuelle et de l'orientation
architecturale des cellules. Les cellules dysplasiques
10 ont souvent des noyaux anormalement grands,
profondément colorés et présentent un pléomorphisme.
Une dysplasie caractéristique se produit lorsqu'il
existe une irritation ou une inflammation chronique et
est souvent observée au niveau du col de l'utérus, dans
15 les voies respiratoires, les cavités buccales et la
vésicule biliaire.
En variante ou en plus de la présence de cellules
se développant de façon anormale caractérisées en tant
qu'hyperplasie, métaplasie ou dysplasie, la présence
20 d'une ou plusieurs caractéristiques d'un phénotype
transformé ou d'un phénotype malin présentées in vivo
ou présentées in vitro par un échantillon cellulaire
d'un patient, peut indiquer l'utilité d'une
administration prophylactique/therapeutique d'un
25 produit thérapeutique de l'invention. Comme on l'a
mentionné ci-dessus, ces caractéristiques d'un
phénotype transformé comprennent les changements de
morphologie, une liaison plus lâche au substrat, une
perte de l'inhibition de contact, une perte de la
30 dépendance d'ancrage, une libération de protease, une
augmentation du transport du sucre, une diminution des
41
besoins sériques, une expression d'antigènes f?taux, la
disparition de la protéine de surface de
250 000 daltons, etc. (voir également ci-dessus, aux pp.
84-90 pour les caractéristiques associées à un
5 phénotype transformé ou malin).
La leucoplasie, une lésion hyperplasique ou
dysplasique d'aspect bénin de 1'epithelium ou la
maladie de Bowen, un carcinome in situ, sont des
lésions pré-néoplasiques indicatives de l'utilité d'une
10 intervention prophylactique.
La maladie fibrokystique (hyperplasie kystique,
dysplasie mammaire, en particulier, adénose
(hyperplasie epitheliale bénigne)) est indicative de
l'utilité d'une intervention prophylactique.
15 Un patient qui présente un ou plusieurs des
facteurs de prédisposition à une malignité suivants
peut être traité par l'administration d'une quantité
efficace de produits thérapeutique : une translocation
chromosomique associée à la malignité (par exemple, le
20 chromosome Philadelphie pour la leucémie myelogene
chonique, t(14 ; 18) pour le lymphome folliculaire,
etc.), la polypöse familiale ou le syndrome de Gardner
(précurseurs éventuels du cancer du côlon), la
gammopathie monoclonale bénigne (un précurseur éventuel
25 de myélomes multiples) et une parentalité de premier
degré avec des personnes souffrant d'un cancer ou d'une
maladie précancéreuse présentant un schéma héréditaire
(génétique) mendélien (par exemple, polypöse familiale
du côlon, syndrome de Gardner, exostose héréditaire,
3 0 adenomatöse polyendocrine, carcinome thyroïdien
médullaire avec production d'amyloïde et
42
phéochromocytome, le syndrome de Peutz-Jeghers, la
neurofibromatose de Von Recklinghausen, le
rétinoblastome, la tumeur du corps carotidien, le
mélanocarcinome cutané, le mélanocarcinome
5 intraoculaire, le xéroderme pigmentaire, 1'ataxie
télangiectasie, le syndrome de Chediak-Higashi,
l'albinisme, l'anémie aplasique de Fanconi et le
syndrome de Bloom : voir Robbins et Angell, 1976, Basic
Pathology, 2eme éd., W.B. Saunders Co., Philadelphie, pp.
10 112-113) etc.
Dans un autre aspect spécifique, un produit
thérapeutique antagoniste de 1'invention est administré
à un patient humain pour prévenir la progression en
cancer du sein, du côlon ou du col de l'utérus.
15
5.2.2. AUTRES TROUBLES
Dans d'autres aspects, un produit thérapeutique de
1'invention peut être administré pour prévenir un
trouble du système nerveux décrit au paragraphe 5.1.2
20 ou d'autres troubles (par exemple, cirrhose du foie,
psoriasis, chéloïdes, calvitie) décrits au paragraphe
5.1.3.
5.3. DEMONSTRATION DE L'UTILITE THERAPEUTIQUE OU
25 PROPHYLACTIQUE
Les produits thérapeutiques de 1'invention peuvent
être utilisés in vivo pour l'activité thérapeutique ou
prophylactique souhaitée. Par exemple, ces composés
peuvent être testés dans des systèmes de modèles
30 animaux appropriés avant de les tester chez l'être
humain, comprenant, de manière non restrictive, les
43
rats, souris, poulets, vaches, singes, lapins, etc.
Pour le test in vivo, avant l'administration à l'être
humain, tout système de modèle animal connu dans l'art
peut être utilisé.
5
5.4. ADMINISTRATION ET COMPOSITIONS THERAPEUTIQUES/
PROPHYLACTIQUES
La description concerne des procédés de traitement
(et de prophylaxie) par l'administration au sujet d'une
10 quantité efficace d'un produit thérapeutique de
l'invention. Dans un aspect préféré, le produit
thérapeutique est substantiellement purifié. Le sujet
est de préférence un animal, comprenant, de manière non
restrictive, les animaux tels que les vaches, les
15 cochons, les poulets, etc. et est de préférence un
mammifère et de manière préférée entre toutes, un être
humain.
Divers systèmes de distribution sont connus et
peuvent être utilisés pour administrer un produit
20 thérapeutique, par exemple, 1'encapsulation dans des
liposomes, des microparticules, des microcapsules,
l'expression par des cellules recombinantes, par
endocytose induite par un récepteur (voir par exemple,
Wu et Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262 : 4429-4432), la
25 construction d'un acide nucléique du produit
thérapeutique en tant que partie d'un vecteur
retroviral ou autre vecteur, etc. Les procédés
d'introduction comprennent, de manière non restrictive,
les voies intradermiques, intramusculaires,
30 intraperitoneales, intraveineuses, sous-cutanées,
intranasales et orales. Les composés peuvent être
44
administrés par toute voie appropriée, par exemple par
perfusion ou injection en bolus, par absorption par les
revêtements épithéliaux ou muco-cutanés (par exemple,
la muqueuse buccale, rectale et intestinale, etc.) et
5 peuvent être administrés conjointement avec d'autres
agents biologiquement actifs. L'administration peut
être systémique ou locale. De plus, il peut être
souhaitable d'introduire les compositions
pharmaceutiques de 1'invention dans le système nerveux
10 central par toute voie appropriée, comprenant
l'injection intraventriculaire et intrathécale ;
l'injection intraventriculaire peut être facilitée par
un cathéter intraventriculaire, par exemple, relié à un
réservoir, tel qu'un réservoir Ommaya.
15 Dans un aspect spécifique, il peut être
souhaitable d'administrer les compositions
pharmaceutiques de 1'invention localement à la zone qui
a besoin d'un traitement ; ceci peut être réalisé par
exemple, et de manière non restrictive, par perfusion
20 locale pendant une intervention chirurgicale,
application topique, par exemple, en association avec
un pansement de plaie après une intervention
chirurgicale, par injection, au moyen d'un cathéter, au
moyen d'un suppositoire ou au moyen d'un implant, ledit
25 implant étant un matériau poreux, non poreux ou
gélatineux comprenant des membranes telles que des
membranes sialastiques ou des fibres. Dans un aspect,
l'administration peut être une injection directe au
niveau du site (ou site antérieur) d'une tumeur maligne
30 pu d'un tissu néoplasique ou pré-néoplasique.
45
Dans un aspect spécifique, l'administration d'un
produit thérapeutique dans une cellule exprimant Notch
est réalisée par une liaison du produit thérapeutique à
une protéine Delta (ou autre protéine toporythmique) ou
5 partie de celle-ci capable d'induire une liaison à
Notch. Le contact d'une cellule exprimant Notch avec le
produit thérapeutique lié entraîne la liaison du
produit thérapeutique lié via sa partie Delta à Notch
sur la surface de la cellule, suivie par l'absorption
10 du produit thérapeutique lié dans la cellule exprimant
Notch.
Dans un aspect spécifique dans lequel un analogue
d'un domaine de transduction de signal intracellulaire
de Notch est utilisé comme produit thérapeutique de
15 telle sorte qu'il puisse inhiber la transduction du
signal de Notch, l'analogue est distribué de préférence
par voie intracellulaire (par exemple, par l'expression
d'un vecteur d'acide nucléique ou par la liaison à une
protéine Delta capable de se lier à Notch puis par la
20 liaison et 1'internalisation ou par des mécanismes
induits par un récepteur).
Dans un aspect dans lequel le produit
thérapeutique est un acide nucléique codant pour un
produit thérapeutique protéique, l'acide nucléique peut
25 être administré in vivo pour favoriser l'expression de
cette protéine codée, en le construisant comme une
partie d'un vecteur d'expression d'acide nucléique
approprié et en l'administrant de sorte qu'il devienne
intracellulaire, par exemple par l'utilisation d'un
30 vecteur retroviral (voir le brevet US n° 4 980 286) ou
par injection directe ou par l'utilisation de
46
10
15
bombardement de microparticules (par exemple, un canon
à gènes ; Biolistic, Dupont) ou revêtement avec des
lipides ou des récepteurs de surface cellulaire ou des
agents de transfection ou en l'administrant en liaison
à un peptide de type boîte homéotique qui est connu
pour entrer dans le noyau (voir par exemple Joliot et
coll., 1991. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 : 1864-1868),
etc. En variante, un produit thérapeutique d'acide
nucléique peut être introduit au niveau intracellulaire
et incorporé dans un ADN de cellule hôte pour
expression, par recombinaison homologue.
Dans des aspects spécifiques concernant le
traitement ou la prévention de troubles particuliers,
de préférence les formes d'administration suivantes
sont utilisées :
Trouble Modes d'administration préférés
Cancer du col de 1'utérus Topique
Cancer gastro-intestinal Oral, intraveineux
Cancer du poumon Inhalation, intraveineux
Leucémie Intraveineux, extracorporel
Carcinome métastasiqùe Intraveineux, oral
Cancer cérébral Ciblé, intraveineux, intrathecal
Cirrhose du foie Oral, intraveineux
Psoriasis Topique
Chéloïdes Topique
Calvitie Topique
Lésion de la moelle Ciblé, intraveineux,

47
épinière intrathecal
Maladie de Parkinson Ciblé, intrathecal intraveineux,
Maladie des neurones Ciblé, intraveineux,
moteurs intrathecal
Maladie d'Alzheimer Ciblé, intrathecal intraveineux,
La présente invention propose également des
compositions pharmaceutiques. Ces compositions
comprennent une quantité efficace sur le plan
5 thérapeutique d'un produit thérapeutique de l'invention
et un véhicule ou un excipient acceptable sur le plan
pharmaceutique. Ce véhicule comprend, de manière non
restrictive, une solution physiologique, une solution
physiologique tamponnée, le dextrose, l'eau, le
10 glycerol, l'éthanol et leurs combinaisons. Le véhicule
et la composition peuvent être stériles. La formulation
doit convenir au mode d'administration.
La composition, si on le souhaite, peut également
contenir des quantités mineures d'agents mouillants ou
15 émulsifiants ou d'agents de tamponnement du pH. La
composition peut être une solution liquide, une
suspension, une emulsion, des comprimés, pilules,
capsules, une formulation à libération prolongée ou une
poudre. La composition peut être formulée en tant que
20 suppositoire avec des liants et véhicules classiques
tels que des triglycérides. La formulation orale peut
comprendre des véhicules standard tels que le mannitol,
le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, la
48
saccharine sodium, la cellulose, le carbonate de
magnésium, etc., de qualité pharmaceutique.
Dans un mode de réalisation préféré, la
composition est formulée selon des processus de routine
5 en tant que composition pharmaceutique adaptée pour
l'administration intraveineuse aux êtres humains.
Habituellement, les compositions pour l'administration
intraveineuse sont des solutions dans un tampon aqueux
isotonique stérile. Si nécessaire, la composition peut
10 également comprendre un agent solubilisant et un
anesthésique local tel que la lignocaine pour soulager
la douleur de l'injection. Généralement, les
ingrédients sont fournis de façon séparée ou mélangés
conjointement en formes galéniques, par exemple sous la
15 forme d'une poudre lyophilisée sèche ou de concentré
anhydre dans un conteneur hermétiquement scellé tel que
dans une ampoule ou un sachet indiquant la quantité
d'agent actif. Si la composition doit être administrée
par perfusion, elle peut être distribuée avec une
20 bouteille de perfusion contenant de l'eau ou une
solution physiologique stérile de qualité
pharmaceutique. Si la composition est administrée par
injection, une ampoule d'eau stérile pour injection ou
de solution physiologique peut être fournie de sorte
25 que les ingrédients puissent être mélangés avant
administration.
Les produits thérapeutiques peuvent être formulés
sous formes neutres ou salines. Les sels acceptables
sur le plan pharmaceutique comprennent ceux formés avec
30 des groupes aminés libres tels que ceux dérivés
d'acides chlorhydrique, phosphorique, acétique,
49
oxalique, tartrique, etc. et ceux formés avec des
groupes carboxyle libres tels que ceux dérivés de
sodium, potassium, ammonium, calcium, hydroxydes
ferriques,. isopropylamine, triéthylamine, 2-éthylamino-
5 éthanol, histidine, procaine, etc.
La quantité de produit thérapeutique de
l'invention qui sera efficace dans le traitement d'un
trouble ou d'une affection particulière dépendra de la
nature du trouble ou de l'affection, et peut être
10 déterminée par des techniques standard. De plus, des
essais in vitro peuvent éventuellement être utilisés
pour aider à identifier des intervalles posologiques
optimaux. La dose précise à utiliser dans la
formulation dépendra également des voies
15 d'administration et de la gravité de la maladie ou du
trouble et doit être décidée selon l'avis du médecin
traitant et des conditions liées à chaque patient.
Toutefois, les intervalles posologiques appropriés pour
l'administration intraveineuse sont généralement
20 d'environ 20 à 500 microns de composé actif par kilo de
poids corporel. Les intervalles posologiques appropriés
pour l'administration intranasale sont généralement
d'environ 0,01 pg/kg de poids corporel à 1 mg/kg de
poids corporel. Des doses efficaces peuvent être
25 extrapolées à partir de courbes dose - réponse dérivées
de systèmes de test in vitro ou.sur modèle animal.
Les suppositoires contiennent généralement
l'ingrédient actif à un niveau de 0,5 % à 10 % en
poids ; les formulations orales contiennent de
30 préférence 10 % à 95 % d'ingrédient actif.
50
La description concerne également un ensemble ou
kit pharmaceutique comprenant un ou plusieurs
récipients remplis d'un ou plusieurs des ingrédients
des compositions pharmaceutiques de la description. On
5 peut éventuellement associer à ce/ces récipient(s), une
notice sous la forme prescrite par l'agence
gouvernementale régulant la fabrication, l'utilisation
ou la vente de produits pharmaceutiques ou de produits
biologiques, ladite notice étant conforme à
10 l'autorisation par l'agence, de la fabrication, de
l'utilisation ou de la vente pour l'administration
humaine.
5.5 REGULATION ANTISENS DE L'EXPRESSION DE NOTCH
15 La présente description propose l'utilisation
thérapeutique ou prophylactique d'acides nucléiques
d'au moins six nucleotides qui sont antisens par
rapport à un gène ou un ADNc codant pour Notch ou une
partie de celui-ci. Le terme "antisens" tel qu'il est
20 utilisé ici fait référence à un acide nucléique capable
de s'hybrider à une partie d'un ARN de Notch (de
préférence, ARNm) grâce à une certaine complémentarité
de séquence. Ces acides nucléiques antisens présentent
une utilité en tant que produits thérapeutiques
25 antisens et peuvent être utilisés dans le traitement ou
la prévention de troubles tels que décrits ci-dessus au
paragraphe 5.1 et dans ses sous-parties.
Les acides nucléiques antisens peuvent être des
oligonucleotides qui sont à double brin ou à brin
30 simple, un ARN ou un ADN ou une modification ou un
dérivé de celui-ci qui peut être administré directement
51
à une cellule ou qui peut être produit au niveau
intracellulaire par transcription de séquences exogènes
introduites.
Dans un aspect spécifique, les acides nucléiques
5 antisens de Notch proposés par la présente description
peuvent être utilisés pour le traitement de tumeurs ou
autres troubles, le type tumoral des cellules ou le
trouble pouvant être démontré {in vitro ou in vivo)
pour exprimer le gène Notch. Cette démonstration peut
10 s'effectuer par la détection de l'ARN de Notch ou de la
protéine Notch.
La description propose en outre des compositions
pharmaceutiques comprenant une quantité efficace
d'acides nucléiques antisens de Notch dans un véhicule
15 acceptable sur le plan pharmaceutique tel que décrit
ci-dessus au paragraphe 5.4. Les procédés de traitement
et de prévention des troubles (tels que ceux décrits
aux paragraphes 5.1 et 5.2) comprenant l'administration
des compositions pharmaceutiques de la description sont
20 également proposés.
Dans un autre aspect, la description concerne des
procédés d'inhibition de l'expression d'une séquence
d'acide nucléique Notch dans une cellule procaryote ou
eucaryote comprenant la fourniture à la cellule d'une
25 quantité efficace d'une composition comprenant un acide
nucléique Notch antisens de l'invention.
Dans un autre aspect, l'identification des
cellules exprimant des récepteurs fonctionnels de Notch
peut être réalisée en observant la capacité de Notch à
3 0 "sauver" ces cellules des effets cytotoxiques d'un
acide nucléique antisens Notch.
52
Dans un autre mode de réalisation de l'invention,
les acides nucléiques antisens par rapport à un acide
nucléique codant pour une protéine toporythmique
("adhesive") ou un fragment de celle-ci qui se lie à
5 Notch sont prévus en tant que produits thérapeutiques.
Les acides nucléiques antisens de Notch et leurs
utilisations sont décrits en détail ci-dessous.
5.5.1. ACIDES NUCLEIQUES ANTISENS DE NOTCH
10 Les acides nucléiques antisens de Notch sont au
moins six nucleotides et sont de préférence des
oligonucleotides (de l'ordre de 6 à environ
50 oligonucleotides). Dans des aspects spécifiques,
1'oligonucleotide comprend au moins 10 nucleotides, au
15 moins 15 nucleotides, au moins 100 nucleotides ou au
moins 200 nucleotides. Les oligonucleotides peuvent
être un ADN, un ARN ou des mélanges chimériques ou
dérivés ou des versions modifiées de ceux-ci, à brin
simple ou à brin double. L'oligonucleotide peut être
20 modifié au niveau d'un fragment de base, d'un fragment
de sucre ou d'uns squelette de phosphate.
L'oligonucleotide peut comprendre d'autres groupes
annexes tels que des peptides ou des agents facilitant
le transport au travers de la membrane cellulaire (voir
25 par exemple, Lessinger et coll., 1989, Proc. Natl. Acad.
Sei. U.S.A. 86 : 6553-6556 ; Lemaître et coll., 1987,
Proc. Natl. Acad. Sei. 84 : 648-652 ; n° de publication
PCT WO 88/09810 publié le 15 décembre 1988) ou la
barrière hémato-encéphalique (voir par exemple la
30 publication PCT n° WO 89/10134 publiée le 25 avril
1988) , des agents de clivage déclenché par hybridation
53
(voir par exemple, Krol et coll., 1988, BioTechniques
6 : 958-976) ou des agents intercalaires (voir par
exemple, Zpn, 1988, Pharm. Res. 5 : 539-549).
Dans un aspect préféré de la description est
5 proposé un oligonucleotide antisens Notch, de
préférence, un ADN à brin simple. Dans un aspect
préféré entre tous, cet oligonucleotide comprend une
séquence antisens par rapport à la séquence codant pour
ELR11 et ELR12 de Notch, de manière préférée entre
10 toutes, de Notch humain. L'oligonucleotide peut être
modifié au niveau d'une position quelconque sur sa
structure, par des substituants généralement connus
dans 1'art.
L'oligonucleotide antisens Notch peut comprendre
15 au moins un fragment de base modifié qui est choisi
dans le groupe comprenant, de manière non restrictive,
le 5-fluoro-uracile, le 5-bromo-uracile, le 5-chloro-
uracile, le 5-iodo-uracile, 1'hypoxanthine, la xantine,
la 4-acétylcytosine, le 5-
20 (carboxyhydroxylméthyl)uracile, la 5-
carboxyméthylaminométhyl-2-thio-uridine, le 5-
carboxyméthylaminométhyluracile, le dihydro-uracile, la
bêta-D-galactosylquéosine, l'inosine, la N6-
isopentényladénine, la 1-méthylguanine, la 1-
25 méthylinosine, la 2,2-diméthylguanine, la 2-
méthyladénine, la 2-méthylguanine, la 3-méthylcytosine,
la 5-méthylcytosine, la N6-adenine, la 7-méthylguanine,
le 5-méthylaminométhyluracile, le 5-méthoxyaminométhyl-
2-thio-uracile, la bêta-D-mannosylquéosine, le 5'-
3 0 méthoxycarboxyméthyluracile, le 5-méthoxyuracile, le 2-
méthylthio-N6-isopentényladénine, l'acide uracil-5-
54
oxyacétique (v), la wybutoxosine, le pseudo-uracile, la
quéosine, la 2-thiocytosine, le 5-méthyl-2-thio-uracile,
le 2-thio-uracile, le 4-thio-uracile, le 5-
méthyluracile, l'acide uracil-5-oxyacétique méthylester,
5 l'acide uracil-5-oxyacétique (v) , le 5-méthyl-2-thio-
uracile, le 3-(3-amino-3-N-2-carboxypropyl)uracile, le
(acp3)w et la 2,6-diaminopurine.
Dans un autre aspect, 1'oligonucleotide comprend
au moins un fragment de sucre modifié choisi dans le
10 groupe comprenant de manière non restrictive,
l'arabinose, le 2-fluoro-arabinose, le xylulose et
1'hexose.
Dans encore un autre aspect, 1'oligonucleotide
comprend au moins un squelette de phosphate modifié
15 choisi dans le groupe comprenant un phosphorothioate,
un phosphorodithioate, un phosphoramidothioate, un
phosphoramidate, un phosphordiamidate, un
méthylphosphonate, un alkyl-phosphotriester et un
formacétal ou un analogue de ceux-ci.
20 Dans encore un autre aspect, 1'oligonucleotide est
un oligonucleotide a-anomëre. Un oligonucleotide oc-
anomère forme des hybrides spécifiques à double brin
avec un ARN complémentaire dans lequel, contrairement
aux unités ß habituelles, les brins sont disposés en
25 parallèle l'un de l'autre (Gautier et coll., 1987, Nucl.
Acids Res. 15 : 6625-6641).
L'oligonucleotide peut être conjugué à une autre
molécule, par exemple un peptide, un agent de
reticulation déclenchée par hybridation, un agent de
30 transport, un agent de clivage déclenché par
hybridation, etc.
55
Les oligonucleotides de l'invention peuvent être
synthétisés par des procédés standard connus dans l'art,
par exemple par l'utilisation d'un synthétiseur d'ADN
automatique (tel que ceux disponibles dans le commerce,
5 de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). A titre
d'exemple, des oligoéléments phosphorothioate peuvent
être synthétisés par le procédé de Stein et coll. (1988,
Nucl. Acids Res. 16 : 3209), les oligoéléments
méthylphosphonate peuvent être préparés en utilisant
10 des supports de verre polymère à pores contrôlés (Sarin
et coll., 1988, Proc. Natl. Acd. Sei. U.S.A. 85 : 7448-
7451) etc.
Dans un aspect spécifique, 1'oligonucleotide
antisens de Notch comprend un ARN catalytique ou un
15 ribozyme (voir par exemple, la publication
internationale PCT WO 90/11364 publiée le 4 octobre
1990 ; Sarver et coll., 1990, Science 247 : 1222-1225).
Dans un autre mode de réalisation, 1'oligonucleotide
est un 2'-O-méthylribonucléotide (Inoue et coll., 1987,
20 Nucl. Acids Res. 15 : 6131-6148) ou un analogue ARN-ADN
chimérique (Inoue et coll., 1987, FEBS Lett. 215 : 327-
330) .
Dans un autre aspect, l'acide nucléique antisens
Notch de 1'invention est produit au niveau
25 intracellulaire par transcription à partir d'une
séquence exogène. Par exemple, un vecteur peut être
introduit in vivo de sorte qu'il soit absorbé par une
cellule, le vecteur ou une partie de celui-ci étant
transcrit(e) dans cette cellule, en produisant un acide
30 nucléique antisens (ARN) de l'invention. Ce vecteur
contiendrait une séquence codant pour l'acide nucléique
56
antisens de Notch. Ce vecteur peut rester épisomal ou
être intégré au niveau chromosomique dans la mesure où
il peut être transcrit pour produire l'ARN antisens
souhaité. Ces vecteurs peuvent être construits par des
5 procédés de la technologie d'ADN recombinant dans l'art.
Les vecteurs peuvent être des plasmides, des vecteurs
viraux ou autres connus dans l'art, utilisés pour la
replication et l'expression de cellules de mammifères.
L'expression de la séquence codant pour l'ARN antisens
10 de Notch peut être tout promoteur connu dans l'art pour
agir dans des cellules de mammifères, de préférence,
d'être humain. Ces promoteurs peuvent être inductibles
ou constitutifs. Ces promoteurs comprennent, de manière
non restrictive : la région du promoteur précoce SV4 0
15 (Bernoist et Chambron, 1981, Nature 290 : 304-310), le
promoteur contenu dans la longue répétition terminale
en 3 ' du virus du sarcome de Rous (Yamamoto et coll.,
1980, Cell 22 : 787-797), le promoteur de la thymidine
kinase de l'herpès (Wagner et coll., 1981, Proc. Natl.
20 Acad. Sei. U.S.A. 78 : 1441-1445), les séquences
régulatrices du gène de la métallothionéine (Brinster
et coll., 1982, Nature 296 : 39-42), etc.
Les acides nucléiques antisens de l'invention
comprennent une séquence complémentaire à au moins une
25 partie d'un produit de transcription d'ARN d'un gène
Notch, de préférence, un gène Notch humain. Toutefois,
une complémentarité absolue, bien qu'elle soit préférée,
n'est pas indispensable. Une séquence "complémentaire à
au moins une partie d'un ARN" telle qu'utilisée ici,
30 désigne une séquence ayant une complémentarité
suffisante pour pouvoir s'hybrider à l'ARN, formant un
57
duplexe stable ; dans le cas des acides nucléiques
antisens Notch à brin double, un brin simple de l'ADN
duplexe peut ainsi être testé ou une formation triplexe
peut être testée. La capacité à s'hybrider dépendra à
5 la fois du degré de complémentarité et de la longueur
de l'acide nucléique antisens. Généralement, plus
l'acide nucléique hybridant est long, plus il peut
contenir des mésappariements de base avec un ARN de
Notch et forme toujours un duplexe stable (ou un
10 triplexe le cas échéant). L'homme du métier pourra
assurer un degré acceptable de mésappariement en
utilisant des processus standard pour déterminer le
point de fusion du complexe hybride.
15 5.5.2. UTILITE THERAPEUTIQUE D'ACIDES NUCLEIQUES
ANTISENS DE NOTCH
Les acides nucléiques antisens de Notch peuvent
être utilisés pour traiter (ou prévenir) les affections
malignes d'un type de cellules qui s'est avéré exprimer
20 l'ARN de Notch. Les cellules malignes, néoplasiques et
prénéoplasiques qui peuvent être testées pour
déterminer cette expression comprennent, de manière non
restrictive, celles décrites ci-dessus aux paragraphes
5.1.1 et 5.2.1. Dans un aspect préféré, un
25 oligonucleotide antisens de Notch à ADN à brin simple
est utilisé.
Les types de cellules malignes (en particulier,
les tumeurs) qui expriment l'ARN de Notch peuvent être
identifiés par divers procédés connus dans l'art. Ces
30 procédés comprennent, de manière non restrictive,
l'hybridation avec un acide nucléique spécifique de
58
Notch (par exemple, par hybridation Northern,
hybridation dot blot, hybridation in situ) en observant
la capacité de l'ARN du type de cellule à traduire in
vitro dans. Notch, etc. Dans un aspect préféré, le tissu
5 tumoral primaire d'un patient peut être testé pour
déterminer l'expression de Notch avant le traitement.
Les compositions pharmaceutiques (voir paragraphe
5.1.4) comprenant une quantité efficace d'acide
nucléique antisens de Notch dans un véhicule acceptable
10 sur le plan pharmaceutique, peuvent être administrées à
un patient souffrant d'une affection maligne qui est du
type qui exprime l'ARN de Notch.
La quantité d'acide nucléique antisens de Notch
qui sera efficace dans le traitement d'un trouble ou
15 d'une affection particulière dépendra de la nature du
trouble ou de l'affection et peut être déterminée par
des techniques cliniques standard. Si possible, il est
souhaitable de déterminer la cytotoxicité antisens du
type de tumeur à traiter in vitro puis, dans des
20 systèmes de modèle animaux utiles avant de la tester et
l'utiliser chez l'être humain.
Dans un aspect spécifique, une composition
pharmaceutique comprenant des acides nucléiques
antisens de Notch est administrée via des liposomes,
25 des microparticules ou des microcapsules. Dans divers
aspects de la description, . il peut être utile
d'utiliser ces compositions pour assurer une libération
prolongée des acides nucléiques antisens de Notch. Dans
un aspect spécifique, il peut être souhaitable
30 d'utiliser des liposomes ciblés via des anticorps à des
antigènes tumoraux identifiables spécifiques (Leonetti
59
et coll., 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87 :
2448-2451 ; Renneisen et coll., 1990, J. Biol. Chem.
265 : 16337-16342).
5 5.6. UTILITE DIAGNOSTIQUE
Les protéines Notch, analogues, dérivés et leurs
sous-séquences, les acides nucléiques de Notch (et les
séquences complémentaires de ceux-ci), les anticorps
anti-Notch et autres protéines toporythmiques et leurs
10 dérivés et analogues de ceux-ci qui interagissent avec
des protéines Notch et des inhibiteurs des interactions
Notch - protéines toporythmiques, ont des utilisations
diagnostiques. Ces molécules peuvent être utilisées
dans des essais tels que des essais immunologiques,
15 pour détecter, prévoir, diagnostiquer ou surveiller
diverses affections, maladies et troubles affectant
l'expression de Notch ou surveiller le traitement de
celles-ci. En particulier, cet essai immunologique est
réalisé par un procédé comprenant la mise en contact
20 d'un échantillon dérivé d'un patient, avec un anticorps
anti-Notch dans des conditions telles que cette liaison
immunospécifique puisse se produire et la détection ou
la mesure de la quantité d'une liaison immunospécifique
par l'anticorps. Dans un aspect spécifique, l'anticorps
25 de Notch peut être utilisé pour doser dans le tissu
d'un patient ou d'un échantillon sérique, la présence
de Notch, un niveau aberrant de Notch étant une
indication d'une affection pathologique.
Les essais immunologiques qui peuvent être
30 utilisés comprennent, de manière non restrictive, des
systèmes d'essais compétitifs et non compétitifs en
60
utilisant des techniques telles que western blots, des
essais radio-immunologique, ELISA (essai immuno-
enzymatique), des immuno-essais en "sandwich", des
essais d'immuno-précipitation, des réactions à la
5 précipitine, des réactions à la précipitine par
diffusion sur gel, des essais d'immunodiffusion, des
essais d'agglutination, des essais de fixation au
complément, des essais immunoradiométriques, des
immuno-essais fluorescents, des immuno-essais à la
10 protéine A, pour n'en citer que quelques-uns.
Les gènes Notch et les séquences et sous-séquences
d'acides nucléiques apparentées, comprenant les
séquences complémentaires et autres séquences de gène
toporythmiques peuvent également être utilisées dans
15 des essais d'hybridation. Les séquences d'acide
nucléique de Notch ou ses sous-séquences comprenant
environ au moins 8 nucleotides, peuvent être utilisées
comme sondes d'hybridation. Des essais d'hybridation
peuvent être utilisés pour détecter, prévoir,
20 diagnostiquer ou surveiller les affections, troubles ou
états pathologiques associés à des changements
aberrants dans l'expression de Notch et/ou son activité,
comme on l'a décrit ci-dessus. En particulier, cet
essai d'hybridation est réalisé par un procédé
25 comprenant la mise en contact d'un échantillon
contenant un acide nucléique avec une sonde d'acide
nucléique capable de s'hybrider à l'ADN ou l'ARN de
Notch dans des conditions telles que l'hybridation
puisse se produire, et la détection ou la mesure d'une
30 hybridation obtenue.
61
Comme cela est détaillé au paragraphe des exemples
10.1 ci-dessous, un accroissement de l'expression de
Notch se produit dans le cancer du sein, du côlon et du
col de l'utérus chez l'être humain. En conséquence,
5 dans des modes de réalisation spécifiques, le cancer du
sein, du côlon ou du col de l'utérus chez l'être humain
ou les changements prémalins dans ces tissus sont
diagnostiqués en détectant l'expression (ou la quantité)
accrue de Notch dans des échantillons provenant de
10 patients par rapport au niveau d'expression de Notch
(ou la quantité) dans un échantillon non malin ou non
pré-malin analogue, le cas échéant, (du patient ou
d'une autre personne, déterminé de façon expérimentale
ou connu par rapport à un niveau standard dans ces
15 échantillons).
Dans un aspect, la protéine Notch (ou un dérivé
présentant une antigénicité de Notch) qui est détectée
ou mesurée se trouve sur la surface cellulaire. Dans un
autre mode de réalisation, la protéine Notch (ou un
20 dérivé) est une molécule soluble dépourvue de cellules
(par exemple, mesurée dans un échantillon de sang ou de
sérum) ou est intracellulaire. Sans souhaiter être liés
systématiquement à une théorie, les demandeurs pensent
que Notch dépourvu de cellules peut résulter de la
25 sécrétion ou de la séparation de la surface cellulaire.
Dans un autre mode de réalisation, des quantités de
protéine Notch soluble, de surface cellulaire et
intracellulaire ou ses dérivés sont détectés ou mesurés.
62
5.7. ACIDES NUCLEIQUES DE NOTCH
Les produits thérapeutiques qui sont des acides
nucléiques de Notch ou des acides nucléiques antisens
de Notch ainsi que des produits thérapeutiques de
5 protéine codant pour des acides nucléiques comprennent
ceux décrits ci-dessous, qui peuvent être obtenus par
des procédés connus dans l'art, et en particulier,
comme on le décrit ci-dessous.
Dans des aspects particuliers, la description
10 propose des séquences d'acides aminés de Notch, de
préférence de Notch humain, et des fragments ou dérivés
de celles-ci comprenant un déterminant antigénique
(c'est-à-dire pouvant être reconnu par un anticorps) ou
qui sont fonctionnellement actifs ainsi que des
15 séquences d'acide nucléique codant pour les précédentes.
Un matériau "fonctionnement actif" tel qu'il est
utilisé ici signifie qu'un matériau présente une ou
plusieurs activités fonctionnelles connues, associées
au produit de protéine Notch de longueur totale (de
20 type sauvage), par exemple, la liaison à Delta, la
liaison à Serrate, la liaison à un autre ligand Notch,
1'antigénicité (la liaison à un anticorps anti-Notch),
etc.
Dans des aspects spécifiques, la description
25 propose des fragments d'une protéine Notch comprenant
au moins 40 acides aminés ou au moins 75 acides aminés.
Dans d'autres aspects, les protéines comprennent ou
consistent essentiellement en un domaine
intracellulaire, une région transmembranaire, un
30 domaine extracellulaire, une région cdclO, des
répétitions Notch/lin-12 ou les répétitions homologues
63
de EGF ou toute combinaison des précédents, d'une
protéine Notch. Les fragments ou fragments comprenant
des protéines, dépourvus de certaines ou de toutes les
répétitions homologues de EGF de Notch sont également
5 proposés. Les acides nucléiques codant pour les
précédents sont proposés.
Dans d'autres aspects spécifiques, la description
propose des séquences de nucleotides et des sous-
séquences de Notch, de préférence de Notch humain
10 comprenant au moins 25 nucleotides, au moins
50 nucleotides ou au moins 150 nucleotides. Les acides
nucléiques codant pour les protéines et les fragments
de protéines décrits ci-dessus sont proposés ainsi que
des acides nucléiques complémentaires de ces acides
15 nucléiques et capables de s'hybrider à ceux-ci. Sans un
aspect, cette séquence complémentaire peut être
complémentaire à une séquence ADNc de Notch d'au moins
25 nucleotides ou d'au moins 100 nucleotides. Dans un
aspect préféré, l'invention utilise des séquences
20 d'ADNc codant pour Notch humain ou une partie de celui-
ci. Dans un aspect spécifique, ces séquences du gène
Notch humain ou d'ADNc sont contenues dans les
plasmides hN3k, hN4k ou hN5k (voir paragraphe 9, ci-
dessous) ou dans le gène correspondant à ceux-ci :
25 cette séquence de protéine Notch humaine peut être
telle que présentée sur les figures 10 (SEQ ID N° : 11)
ou 11 (SEQ ID N° : 13). Dans d'autres aspects, l'acide
nucléique Notch et/ou sa protéine codée a au moins une
partie de la séquence présentée dans l'une des
30 publications suivantes : Wharton et coll., 1985, Cell
43 : 567-581 (Notch de Drosophila) ; Kidd et coll.,
64
1986, Mol. Cell. Biol. 6 : 3094-3108 (Notch de
Drosophila) ; Coffman et coll., 1990, Science 249 :
1438-1441 (Notch de Xenopus) ; Ellisen et coll., 1991,
Cell 66 : 649-661 (un Notch humain) . Dans un autre
5 aspect, les séquences de Notch humain sont celles
codant pour les séquences d'acides aminés Notch
humaines ou une partie de celles-ci comme le montre la
figure 13. Dans des aspects particuliers, les séquences
Notch humaines sont celles de l'homologue hN
10 (représenté en partie par le plasmide nH5k) ou
1'homologue TAN-1.
Dans un aspect de la description, la description
concerne la protéine Notch humaine de longueur totale
codée par l'homologue. hN représenté par la figure 13,
15 contenant à la fois la séquence de signal (c'est-à-dire
la protéine précurseur ; les acides aminés 1-2169) et
dépourvue de la séquence de signal (c'est-à-dire la
protéine mature ; les acides aminés -26-2169) ainsi que
les parties des précédents (par exemple, le domaine
20 extracellulaire, la région de répétition homologue de
EGF, les répétitions de type EGF 11 et 12, les
répétitions cdc-10/ankyrine, etc.) et les protéines
comprenant les précédents ainsi que les acides
nucléiques codant pour les précédents.
25 Comme on le comprendra facilement, tel qu'utilisé
ici, "acide nucléique codant pour un fragment ou une
partie d'une protéine Notch" sera élaboré en se
référant à un acide nucléique codant uniquement le
fragment ou la partie défini(e) de la protéine Notch et
30 non d'autres parties de la protéine Notch.
65
Dans un aspect préféré mais non restrictif de la
description, la séquence ADN de Notch peut être clonée
et séquencée par le procédé décrit au paragraphe 9 ci-
dessous.
5 Dans un autre aspect préféré, une PCR est utilisée
pour amplifier la séquence souhaitée dans la
bibliothèque, avant la sélection. Par exemple, les
amorces d'oligonucleotides représentant une partie des
domaines adhésifs codés par un homologue du gène
10 souhaité peuvent être utilisées comme amorces dans la
PCR.
Les procédés ci-dessus ne sont pas censés limiter
la description générale suivante des procédés par
lesquels des clones de Notch peuvent être utilisés.
15 Une cellule eucaryote peut servir potentiellement
de source d'acide nucléique pour le clonage moléculaire
du gène Notch. L'ADN peut être obtenu par des procédés
standard connus dans 1'art à partir de l'ADN clone (par
exemple, une "bibliothèque" d'ADN, par synthèse
20 chimique, par le clonage de l'ADNc ou par le clonage de
l'ADN génomique ou leurs fragments, purifié à partir de
cellule humaine souhaitée (voir par exemple, Sambrook
et coll., 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, 2eme éd., Cold Spring
25 Harbor, New York ; Glover, D.M. (éd.) 1985, DNA
Cloning : A Practical approach, MRL Press Ltd., Oxford,
R.U. vol. I, II). Les clones dérivés d'ADN génomique
peuvent contenir des régions régulatrices et ADN
d'introns en plus des régions codantes : les clones
30 dérivés d'ADNc ne contiendront que des séquences d'exon.
Quelle que soit la source, le gène doit être clone au
66
niveau moléculaire dans un vecteur approprié pour la
propagation du gène.
Dans le clonage moléculaire du gène de l'ADN
génomique, des fragments d'ADN sont générés, dont
5 certains coderont le gène souhaité. L'ADN peut être
clivé au niveau de sites spécifiques en utilisant
diverses enzymes de restriction. En variante, on peut
utiliser 1'ADNase en présence de manganèse pour
fragmenter l'ADN ou l'ADN peut être coupé, par exemple,
10 par sonication. Des fragments d'ADN linéaires peuvent
ensuite être séparés selon la taille par des techniques
standard comprenant, de manière non restrictive,
1'électrophorèse sur gel d'agarose et de Polyacrylamide
et la Chromatographie en colonne.
15 Une fois que les fragments d'ADN sont générés,
l'identification de fragments d'ADN spécifiques
contenant le gène souhaité peut être réalisée par
diverses façons. Par exemple, si une quantité d'une
partie d'un gène Notch (de toute espèce) ou son ARN
20 spécifique ou un fragment de celui-ci, par exemple, le
domaine adhésif, est disponible et peut être purifié et
marqué, les fragments d'ADN générés peuvent être
criblés par hybridation d'acide nucléique à la sonde
marquée (Benton, W. et Davis, R. , 1977, Science 196,
25 180 ; Grunstein, M. et Hogness, D., 1975, Proc. Natl.
Acad. Sei. U.S.A. 72, 3961). Ces fragments d'ADN
présentant une homologie substantielle avec la sonde
seront hybrides. Il est également possible d'identifier
le fragment approprié par digestion(s) par enzyme de
30 restriction et comparaison des tailles de fragments
avec celles attendues selon une carte de restriction
67
connue si elle est disponible. Une nouvelle sélection
peut être réalisée sur la base des propriétés du gène.
En variante, la présence du gène peut être détectée par
des essais basés sur les propriétés physiques,
5 chimiques ou immunologiques de son produit exprimé. Par
exemple, des clones d'ADNc ou des clones d'ADN peuvent
être choisis, qui hybrident - sélectionnent les ARNm
appropriés, qui produisent une protéine qui a par
exemple, une migration électrophorétique, un
10 comportement de focalisation isoélectrique, des cartes
de digestion protéolytique, une activité d'agrégation
in vitro ("adhésivité") ou des propriétés antigéniques
connues pour Notch, similaires ou identiques. Si un
anticorps anti-Notch est disponible, la protéine Notch
15 peut être identifiée par liaison de l'anticorps marqué
aux clones synthétisant Notch putatif dans un processus
de type ELISA (essai immuno-enzymatique).
Le gène Notch peut également être identifié par
sélection d'ARNm, par hybridation d'acide nucléique
20 suivie par une traduction in vitro. Dans ce procédé,
des fragments sont utilisés pour isoler des ARNm
complémentaires par hybridation. Ces fragments d'ADN
peuvent représenter l'ADN de Notch disponible, purifié
d'une autre espèce (par exemple, Drosophila). L'analyse
25 par immunoprécipitation ou les essais fonctionnels (par
exemple, la capacité d'agrégation in vitro ; voir les
exemples ci-dessous) des produits de traduction in
vitro des produits isolés des ARNm isolés identifie
l'ARNm et par conséquent, les fragments d'ADN
30 complémentaires qui contiennent les séquences
souhaitées. De plus, les ARNm spécifiques peuvent être
68
choisis par adsorption de polysomes isolés de cellules
aux anticorps immobilisés dirigés spécifiquement contre
la protéine Notch ou Delta. Un ADNc . de Notch
radiomarqué peut être synthétisé en utilisant l'ARNm
5 choisi (des polysomes adsorbés) comme matrice. L'ARNm
ou l'ADNc radiomarqué peut ensuite être utilisé comme
sonde pour identifier les fragments d'ADN Notch parmi
d'autres fragments d'ADN génomiques.
Les variantes à l'isolement de l'ADN génomique de
10 Notch comprennent, de manière non restrictive, la
synthèse chimique de la séquence du gène elle-même
d'une séquence connue ou la production d'un ADNc en
ARNm qui code pour le gène Notch. Par exemple, l'ARN
pour le clonage de l'ADNc du gène Notch peut être isolé
15 à partir des cellules qui expriment Notch. D'autres
procédés sont possibles et dans le cadre de la
description.
Le gène identifié et isolé peut ensuite être
inséré dans un vecteur de clonage approprié. Un grand
20 nombre de systèmes vecteur - hôte dans l'art peut être
utilisé. Les vecteurs possibles comprennent, de manière
non restrictive, des plasmides ou des virus modifiés
mais le système de vecteur doit être compatible avec la
cellule hôte utilisée. Ces vecteurs comprennent, de
25 manière non restrictive, les bacteriophages tels que
les dérivés lambda ou les plasmides tels que PBR322 ou
les dérivés de plasmide pUC. L'insertion dans un
vecteur de clonage peut par exemple, être réalisée par
ligature du fragment d'ADN dans un vecteur de clonage
30 qui a des terminaisons cohésives complémentaires.
Toutefois, si les sites de restriction complémentaire
69
utilisés pour fragmenter l'ADN ne sont pas présents
dans le vecteur de clonage, les extrémités des
molécules d'ADN peuvent être modifiées enzymatiquement.
En variante, tout site souhaité peut être produit par
5 ligature des séquences de nucleotides (segments de
liaison) sur les terminaisons d'ADN : ces segments de
liaison liés peuvent comprendre des oligonucleotides
synthétisés chimiquement, codant pour des séquences de
reconnaissance de 1'endonucléase de restriction. Dans
10 un autre procédé, le vecteur clivé et le gène Notch ou
Delta peuvent être modifiés par extension
homopolymérique. Les molécules recombinantes peuvent
être introduites dans des cellules hôtes via
transformation, transfection, infection,
15 électroporation etc., de sorte que de nombreuses copies
de la séquence du gène soient générées.
Dans un autre procédé, le gène souhaité peut être
identifié et isolé après insertion dans un vecteur de
clonage approprié dans une approche de clonage "en
20 aveugle". L'enrichissement du gène souhaité, par
exemple par fractionnement de taille, peut être réalisé
avant insertion dans le vecteur de clonage.
Dans des aspects spécifiques, la transformation
des cellules hôtes avec des molécules d'ADN recombinant
25 qui incorporent le gène Notch isolé, l'ADNc ou la
séquence ADN synthétisée, permet la génération de
multiples copies du gène. Ainsi, le gène peut être
obtenu en grandes quantités par la culture dé
transformants, l'isolement des molécules d'ADN
30 recombinants des transformants et si nécessaire, la
récupération du gène inséré de l'ADN recombinant isolé.
70
Les séquences Notch proposées par la présente
description comprennent les séquences de nucleotide
codant substantiellement pour les mêmes séquences
d'acides aminés que celles observées dans la protéine
5 Notch native et les séquences d'acides aminés codées
qui équivalent fonctionnellement aux acides aminés,
toutes étant décrites au paragraphe 5.6 ci-dessous pour
les dérivés de Notch.
Des procédés similaires à ceux décrits ci-dessus
10 peuvent être utilisés pour obtenir un acide nucléique
codant pour Delta, Serrate ou des parties adhésives de
ceux-ci ou un autre gène toporythmique intéressant.
Dans un aspect spécifique, l'acide nucléique Delta a au
moins une partie de la séquence présentée sur la figure
15 1 (SEQ ID N° : 1) . Dans un autre aspect spécifique,
l'acide nucléique Serrate a au moins une partie de la
séquence présentée sur la figure 5 (SEQ ID N° : 3). Les
séquences d'acide nucléique codant pour les protéines
toporythmiques peuvent être isolées de sources porcine,
20 bovine, féline, aviaire, équine ou canine ainsi que de
sources primates et toute autre espèce dans laquelle
des homologues de gènes toporythmiques connus [y
compris, de manière non restrictive, les gènes suivants
(la publication des séquences étant indiqués entre
25 parenthèses) : Delta (Vassin et coll., 1987, EMBO J. 6,
3431-3440 ; Kopczynski et coll., 1988, Genes Dev. 2,
1723-1735 ; noter les corrections apportées à la
séquence de Kopczynski et coli. présentées sur la
figure 1 de celle-ci (SEQ ID N° : 1 et SEQ ID N° : 2))
30 et Serrate (Fleming et coll., 1990, Genes & Dev. 4,
2188-2201)] peuvent être identifiés. Ces séquences
71
peuvent être modifiées par substitutions, additions ou
deletions qui donnent des molécules fonctionnellement
équivalentes telles que décrites ci-dessus.
5 5.8._____PRODUCTION RECOMBINANTE DES PRODUITS
THERAPEUTIQUES PROTEIQUES
L'acide nucléique codant pour un produit
thérapeutique protéique peut être inséré dans un
vecteur d'expression approprié, c'est-à-dire un vecteur
10 qui contient les éléments nécessaires pour la
transcription et la traduction de la séquence codant
pour la protéine insérée. Les signaux de transcription
et de traduction nécessaires peuvent également être
fournis par le gène toporythmique natif et/ou ses
15 régions flanquantes. Divers systèmes hôte - vecteur
peuvent être utilisés pour exprimer la séquence codant
pour la protéine. Ceux-ci comprennent de manière non
restrictive, des systèmes de cellules de mammifères
infectés par le virus (par exemple, le virus de la
20 vaccine, 1'adenovirus, etc.) ; des systèmes de cellules
d'insectes infectés par le virus (par exemple,
baculovirus) ; des microorganismes tels que des levures
contenant des vecteurs levures ou des bactéries
transformées avec des bacteriophages, des ADN, ADN de
25 plasmide ou ADN de cosmide. Les éléments d'expression
de vecteurs varient dans leurs puissances et leurs
spécificités. En fonction du système hôte - vecteur
utilisé, un nombre quelconque d'éléments de
transcription et de traduction approprié peut être
30 utilisé. Dans un aspect spécifique, la partie adhesive
du gène Notch, par exemple, les répétitions de type EGF
72
codantes (ELR) 11 et 12, est exprimée. Dans d'autres
modes de réalisation spécifiques, le gène Notch humain
est exprimé ou une séquence codant pour une partie
fonctionnellement active de Notch humain.
5 L'un quelconque des procédés précédemment décrits
pour l'insertion de fragments d'ADN dans un vecteur
peut être utilisé pour construire des vecteurs
d'expression contenant un gène chimérique constitué de
signaux de contrôle transcriptionnel/traductionnel et
10 des séquences codantes pour la protéine. Ces procédés
peuvent comprendre l'ADN recombinant in vitro et les
techniques synthétiques et recombinants in vivo
(recombinaison génétique). L'expression de la séquence
d'acide nucléique codant pour une protéine Notch ou un
15 fragment de peptide peut être régulée par une deuxième
séquence d'acide nucléique de sorte que la protéine ou
le peptide Notch soit exprimé (e) dans un hôte
transformé, avec la molécule d'ADN recombinant. Par
exemple, l'expression d'une protéine Notch peut être
20 contrôlée par tout élément promoteur/amplificateur
connu dans 1'art. Les promoteurs qui peuvent être
utilisés pour contrôler l'expression du gène
toporythmique comprennent de manière non restrictive,
la région du promoteur précoce SV4 0 (Bernoist et
25 Chambon, 1981, Nature 290, 304-310), le promoteur
contenu dans la longue répétition terminale en 3 ' du
virus du sarcome de Rous (Yamamoto et coll., 1980, Cell
22, 787-797), le promoteur de la thymidine kinase de
l'herpès (Wagner et coll., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei.
30 U.S.A. 78, 1441-1445), les séquences régulatrices du
gène de la métallothionéine (Brinster et coll., 1982,
73
Nature 296, 39-42) ; les vecteurs d'expression
procaryotes tels que le promoteur de la ß-lactamase
(Villa-Kamaroff et coll., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei.
U.S.A. 75, 3727-3731) ou le promoteur tac (DeBoer et
5 coll., 1983. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 21-25) ;
voir également "Useful proteins from recombinant
bacteria" dans Scientific American, 1980, 242, 74-94 ;
les vecteurs d'expression végétaux comprenant la région
du promoteur de la nopaline synthetase (Herrera-
10 Estrella et coll., Nature 303, 209-213) ou le promoteur
ARN 35S du virus mosaïque du chou-fleur (Gardner et
coll., 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2871) et le promoteur
de l'enzyme photosynthétique binulose biphosphate
carboxylate (Herrera-Estrella et coll., 1984, Nature
15 310, 115-120) ; les éléments promoteurs de la levure ou
autres champignons tels que le promoteur Gai 4, le
promoteur ADC (alcool déshydrogénase), le promoteur PGK
(phosphoglycérol kinase), le promoteur de la
phosphatase alcaline et les régions de contrôle
20 transcriptionnel animales suivantes qui présentent une
spécificité tissulaire et ont été utilisées chez les
animaux transgéniques : région de contrôle de gène de
l'élastase 1 qui est active dans les cellules acinaires
pancréatiques (Swift et coll., 1984, Cell 38, 639-646 ;
25 Ornitz et coll., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol. 50, 399-409 ; MacDonald 1987, Hepatology 7, 425-
515) ; la région de contrôle du gène de l'insuline qui
est active dans les cellules bêta pancréatiques
(Hanahan, 1985, Nature 315, 115-122), la région de
30 contrôle du gène de 1 ' Immunoglobuline qui est active
dans les cellules lymphoïdes (Grosschedl et coll., 1984,
74
Cell 38, 647-658 ; Adamed et coll., 1985, Nature 318,
533-538 ; Alexander et coll., 1987, Mol. Cell Biol. 7,
143 6-1444), la région de contrôle du virus de tumeur
mammaire de souris qui est active dans les cellules
5 testiculaires, mammaires, les lymphoïdes et les
mastocytes (Leder et coll., 1986, Cell 45, 485-495), la
région de contrôle du gène de l'albumine qui est activé
dans le foie (Pinkert et coll., 1987, Genes et Devel, 1,
268-276), la région de contrôle du gène de l'alpha-
10 fétoprotéine qui est active dans le foie (Krumlauf et
coll., 1985, Mol. Cell Biol. 5, 1639-1648 ; Hammer et
coll., 1987, Science 235, 53-58 ; la région de contrôle
du gène de l'alpha 1-atitrypsine qui est active dans le
foie (Kelsey et coll.? 1987, Genes et Devel 1, 161-171),
15 la région de contrôle du gène de la bêta-globine qui
est activé dans les cllules myéloïdes (Mogram et coll.,
1985, Nature 315, 338-340 ; Kollias et coll., 1986,
Cell 46, 89-94) ; la région de contrôle du gène de la
protéine basique de la myéline qui est active dans les
20 cellules d'oligodendrocytes dans le cerveau (Readhead
et coll., 1987, Cell 48, 703-712) ; la région de
contrôle du gène de la chaîne légère de la myosine 2
qui est active dans les muscles squelettiques (Sani,
1985, Nature 314, 283-286) et la région de contrôle du
25 gène de libération de l'hormone gonadotropique qui est
active dans l'hypothalamus (Mason et coll., 1986,
Science 234, 1372-1378).
Les vecteurs d'expression contenant les inserts de
gène Notch peuvent être identifiés par trois approches
3 0 générales : (a) hybridation d'acide nucléique, (b)
présence ou absence de fonctions de gène "marqueur" et
75
(c) expression des séquences insérées. Dans une
première approche, la présence d'un gène étranger
inséré dans un vecteur d'expression peut être détectée
par hybridation d'acide nucléique en utilisant des
5 sondes comprenant des séquences qui sont homologues à
un gène toporythmique inséré. Dans une deuxième
approche, le système vecteur/hôte recombinant peut être
identifié et choisi sur la base de la présence ou de
l'absence de certaines fonctions de gène "marqueur"
10 (par exemple, l'activité de thymidine kinase, la
résistance aux antibiotiques, le phénotype de
transformation, la formation de corps d'occlusion dans
un baculovirus, etc.) provoquée par l'insertion de
gènes étrangers dans le vecteur. Par exemple, si le
15 gène Notch est inséré dans la séquence du gène marqueur
du vecteur, des recombinants contenant l'insert Notch
peuvent être identifiés par l'absence de la fonction de
gène marqueur. Dans la troisième approche, des vecteurs
d'expression recombinants peuvent être identifiés par
20 le dosage du produit de gène étranger exprimé par le
recombinant. Ces essais peuvent être basés, par exemple,
sur les propriétés physiques ou fonctionnelles du
produit de gène Notch dans des systèmes d'essai in
vitro, par exemple, la capacité (adhesive) d'agrégation
25 (voir les paragraphes 6-7 ci-dessous).
Une fois que la molécule d'ADN recombinant
particulière est identifiée et isolée, plusieurs
procédés connus dans l'art peuvent être utilisés pour
le propager. Une fois qu'un système hôte et que des
30 conditions de croissance appropriés sont établis, des
vecteurs d'expression recombinants peuvent être
76
propagés et préparés en quantité. Comme on 1'a expliqué
précédemment, les vecteurs d'expression qui peuvent
être utilisés comprennent, de manière non restrictive,
les vecteurs suivants ou leurs dérivés : les virus
5 humains ou animaux tels que le virus de la vaccine ou
des adenovirus ; les virus d'insecte tels que des
baculovirus ; des vecteurs de levure ; des vecteurs de
bacteriophage (par exemple, lambda) et des vecteurs
d'ADN de plasmide et cosmide, pour n'en citer que
10 quelques-uns.
De plus, une souche de cellule hôte peut être
choisie, qui module l'expression des séquences insérées
ou modifie et traite le produit de gène de la façon
spécifique souhaitée. L'expression de certains
15 promoteurs peut être élevée en présence de certains
inducteurs ; ainsi, l'expression de la protéine Notch
modifiée génétiquement peut être contrôlée. En outre,
différentes cellules hôtes ont des mécanismes
caractéristiques et spécifiques pour le traitement et
20 la modification traductionnelles et post-
traductionnelle (par exemple, glycosylation, clivage)
des protéines. Des lignées de cellules appropriées ou
des systèmes hôtes peuvent être choisis pour assurer la
modification et le traitement souhaités de la protéine
25 étrangère exprimée. Par exemple, l'expression dans un
système bactérien peut être utilisée pour produire un
produit de protéine centrale non glycosylée.
L'expression dans la levure donnera un produit
glycosylé. L'expression dans des cellules de mammifère
3 0 peut être utilisée pour s'assurer de la glycosylation
"native" d'une protéine toporythmique de mammifère
77
hétérologue. En outre, différents systèmes d'expression
vecteur/hôte peuvent affecter les réactions de
traitement telles que les clivages protéolytiques dans
différentes mesures.
5 Dans d'autres aspects spécifiques, la protéine
Notch, des fragments, analogues ou dérivés peuvent être
exprimés en tant que produit de fusion ou de protéine
chimérique (comprenant les protéines, fragments,
analogues où dérivés joints via une liaison peptide à
10 une séquence de protéine hétérologue (d'une protéine
différente)). Ce produit chimérique peut être produit
par ligature des séquences d'acide nucléique
appropriées codant pour les séquences d'acides aminés
souhaités les unes aux autres par des procédés connus
15 dans l'art, dans le cadre codant approprié et par
l'expression du produit chimérique par des procédés
généralement connus dans l'art. En variante, ce produit
chimérique peut être produit par des techniques de
synthèse des protéines, par exemple, par l'utilisation
20 d'un synthétiseur de peptide.
Les séquences d'ADNc et génomiques peuvent être
t clonées et exprimées.
Dans d'autres aspects, une séquence d'ADNc Notch
peut être intégrée et exprimée au niveau chromosomique.
25 Des processus de recombinaison homologue connus dans
l'art peuvent être utilisés.
5.8.1 IDENTIFICATION ET PURIFICATION DU PRODUIT DE GENE
EXPRIME
3 0 Une fois qu'un recombinant qui exprime la séquence
de gène Notch est identifié, le produit de gène peut
78
être analysé. On peut y parvenir par des essais basés
sur les propriétés physiques ou fonctionnelles du
produit, comprenant le marquage radioactif du produit
suivi de 1'analyse par électrophorèse sur gel.
5 Une fois que la protéine Notch est identifiée,
elle peut être isolée et purifiée par des procédés
standard comprenant la Chromatographie (par exemple,
échange d'ions, affinité et Chromatographie en colonne),
centrifugation, solubilité différentielle ou par toute
10 autre technique standard pour la purification des
protéines. Les propriétés fonctionnelles peuvent être
évaluées en utilisant un essai approprié comprenant, de
manière non restrictive, des essais d'agrégation (voir
paragraphes 6-7).
15
5.9. DERIVES ET ANALOGUES DES PROTEINES NOTCH ET AUTRES
PROTEINES TOPORYTHMIQUES
La description concerne en outre l'utilisation,
comme produit thérapeutique ou dérivé (comprenant, sans
20 se limiter aux fragments), des analogues des protéines
Notch. D'autres protéines toporythmiques et dérivés et
analogues de celles-ci ou des ligands Notch sont
également proposées en tant que produits thérapeutiques,
en particulier, qui favorisent ou en variante, inhibent
25 les interactions de ces autres protéines toporythmiques
avec Notch.
La production et l'utilisation de dérivés et
d'analogues associés à Notch entrent dans le cadre de
la présente description. Dans une espèce spécifique, le
30 dérivé ou l'analogue est fonctionnellement actif,
c'est-à-dire capable de présenter une ou plusieurs
79
activités fonctionnelles associées à une protéine Notch
de type sauvage de longueur totale. A titre d'exemple,
les dérivés ou analogues qui ont 1'antigénicité
souhaitée peuvent être utilisés, par exemple dans des
5 essais immunologiques diagnostiques tels que décrits au
paragraphe 5.3. Les molécules qui conservent ou
éventuellement inhibent une propriété souhaitée de
Notch, par exemple se liant à Delta ou d'autres
protéines toporythmiques, se liant à un ligand
10 intracellulaire, peuvent être utilisées
thérapeutiquement comme inducteurs ou inhibiteurs,
respectivement, de cette propriété et leurs
correspondants physiologiques. Les dérivés ou analogues
de Notch peuvent être testés pour déterminer l'activité
15 souhaitée par des procédés connus dans l'art,
comprenant de manière non restrictive, les essais tels
que décrits ci-dessous. Dans un aspect spécifique, des
bibliothèques de peptides peuvent être criblées pour
choisir un peptide présentant l'activité souhaitée ; ce
20 criblage peut être réalisé en testant, par exemple, la
liaison à Notch ou un partenaire de liaison de Notch
tel que Delta.
Les dérivés de Notch peuvent être réalisés en
modifiant des séquences Notch par substitutions,
25 additions ou deletions qui donnent des molécules
fonctionnellement équivalentes. En raison de la
dégénérescence de séquences codant pour le nucleotide,
d'autres séquences ADN qui codent substantiellement
pour la même séquence d'acides aminés qu'un gène Notch
3 0 peuvent être utilisées. Celles-ci comprennent, de
manière non restrictive, les séquences de nucleotides
80
comprenant tout ou parties des gènes Notch qui sont
modifiés par la substitution de différents codons qui
codent pour un résidu d'acides aminés fonctionnellement
équivalent dans la séquence, produisant ainsi un
5 changement silencieux. De même, les dérivés de Notch
comprennent, de manière non restrictive, ceux contenant,
comme séquences d'acides aminés primaires, tout ou
partie de la séquence d'acides aminés d'une protéine
Notch comprenant des séquences modifiées dans
10 lesquelles des résidus d'acides aminés
fonctionnellement équivalents sont substitués par des
résidus dans la séquence, donnant un changement
silencieux. Par exemple, un ou plusieurs résidus
d'acides aminés dans la séquence peuvent être
15 substitués par un autre acide aminé d'une polarité
similaire qui agit comme équivalent fonctionnel,
donnant une modification silencieuse. Les substituts
d'un acide aminé dans la séquence peuvent être choisis
à partir d'autres éléments de la classe à laquelle
20 l'acide aminé appartient. Par exemple, les acides
aminés non polaires (hydrophobes) comprennent 1'alanine,
la leucine, 1'isoleucine, la valine, la proline, la
phenylalanine, le tryptophane et la methionine. Les
acides aminés polaires neutres comprennent la glycine,
25 la serine, la threonine, la cysteine, la tyrosine,
l'asparagine et la glutamine. Les acides aminés à
charge positive (basiques) comprennent 1'arginine, la
lysine et l'histidine. Les acides aminés à charge
négative (acides) comprennent l'acide aspartique et
30 l'acide glutamique.
81
Les dérivés ou analogues de Notch comprennent, de
manière non restrictive, les peptides qui sont
substantiellement homologues à Notch ou ses fragments
ou dont l'acide nucléique codant est capable de
5 s'hybrider à une séquence d'acide nucléique de Notch.
Les dérivés et analogues de Notch de la
description peuvent être produits par divers procédés
connus dans 1'art. Les manipulations qui entraînent
leur production peuvent se produire au niveau du gène
10 ou de la protéine. Par exemple, la séquence du gène
Notch clone peut être modifiée par l'une quelconque des
nombreuses stratégies connues dans l'art (Maniatis, T.
1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2eme éd.,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
15 York) . La séquence peut être clivée au niveau de sites
appropriés avec une/des endonucléase(s) de restriction
suivie d'une nouvelle modification enzymatique si on le
souhaite, isolée et digérée in vitro. Dans la
production du gène codant pour un dérivé ou un analogue
20 de Notch, il faut veiller à s'assurer que le gène
modifié reste dans le même cadre de lecture
traductionnel que Notch, non interrompu par des signaux
d'arrêt de traduction dans la région du gène dans
laquelle l'activité de Notch souhaitée est codée.
25 La séquence d'acide nucléique non codante peut
être mutée in vitro ou in vivo, pour créer des
variations dans les régions codantes et/ou former de
nouveaux sites d'endonucléases de restriction ou
détruire ceux préexistants, pour faciliter encore la
3 0 modification in vitro. Toute technique de mutagenèse
connue dans l'art peut être utilisée, comprenant de
82
manière non restrictive, une mutagenèse ciblée in vitro
(Hutchinson, C. et coll., 1978, J. Biol. Chem. 253 :
6551), l'utilisation de segments de liaison TAB®
(Pharmacia, etc.)
5 Des manipulations de la séquence Notch peuvent
également être réalisées au niveau protéique. La
description comprend des fragments de protéine Notch ou
autres dérivés ou analogues qui sont modifiés
différemment pendant ou après la traduction, par
10 exemple par glycosylation, acétylation, phosphorylation,
amidation, dérivatisation par des groupes de
protection/blocage connus, clivage protéolytique,
liaison à une molécule d'anticorps ou un autre ligand
cellulaire, etc. L'une quelconque des nombreuses
15 modifications chimiques peut être réalisée par des
techniques connues comprenant, de manière non
restrictive, le clivage chimique spécifique par bromure
de cyanogène, trypsine, chymotrypsine, papaïne,
protease V8, NaBH4 : acétylation, formylation,
20 oxydation, réduction ; synthèse métabolique en présence
de tunicamycine, etc.
De plus, des analogues et dérivés de Notch peuvent
être synthétisés chimiquement. Par exemple, un peptide
correspondant à une partie d'une protéine Notch qui
25 comprend le domaine souhaité ou qui induit l'activité
d'agrégation souhaitée in vitro ou la liaison à un
récepteur, peut être synthétisé en utilisant un
synthétiseur peptidique. En outre, si on le souhaite,
des acides aminés non classiques ou analogues d'acides
30 aminés chimiques peuvent être introduits comme
substitution ou addition dans la séquence Notch. Les
83
acides aminés non classiques comprennent, de manière
non restrictive, les isomères D des acides aminés
courant, l'acide ct-amino isobutyrique, l'acide 4-
aminobutyrique, 1'hydroxyproline, la sarcosine, la
5 citrulline, l'acide cystéique, la t-butylglycine, le t-
butylalanine, la phénylglycine, la cyclohexylalanine,
la ß-alanine, les acides aminés concepteurs tels que
les acides ß-méthyl-aminés, les acides Ca-méthyl-aminés,
et les acides Na-méthylaminés.
10 Dans un aspect spécifique, le dérivé Notch est une
protéine chimérique ou de fusion, comprenant une
protéine Notch ou un fragment de celle-ci fusionnée via
une liaison peptide au niveau de sa terminaison amino
et/ou carboxy à une séquence d'acide aminé non Notch.
15 Dans un aspect, cette protéine chimérique est produite
par l'expression recombinante d'un acide nucléique
codant pour la protéine (comprenant une séquence codant
pour Notch, jointe dans le cadre à une séquence codante
non Notch). Ce produit chimérique peut être produit par
20 ligature des séquences d'acide nucléique appropriées
codant pour les séquences d'acide aminé choisies les
unes aux autres par des procédés connus dans l'art,
dans le cadre codant approprié et expression du produit
chimérique par des procédés couramment connus dans
25 l'art. En variante, ce produit chimérique peut être
obtenu par des techniques de synthèse de protéine, par
exemple par l'utilisation d'un synthétiseur de peptide.
Dans un aspect spécifique, un acide nucléique codant
pour une protéine Notch mature avec une séquence de
30 signal hétérologue est exprimé de telle sorte que la
protéine chimérique soit exprimée et traitée par la
84
cellule à la protéine Notch mature. A titre d'autre
exemple, et de manière non restrictive, une molécule
recombinante peut être construite, comprenant des
parties codantes de Notch et un autre gène
5 toporythmique, par exemple, Delta. La protéine codée de
cette molécule recombinante pourrait exprimer des
propriétés associées à la fois à Notch et à Delta et
représenter un nouveau profil d'activités biologiques,
comprenant des agonistes ainsi que des antagonistes. La
10 séquence primaire de Notch et de Delta peut également
être utilisée pour prévoir la structure tertiaire des
molécules en utilisant la stimulation par ordinateur
(Hopp et Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78 :
3824-3828) ; les gènes recombinants chimériques
15 Notch/Delta pourraient être conçus à la lumière des
corrélations entre la structure tertiaire et la
fonction biologique. De même, des gènes chimériques
comprenant des parties de Notch fusionnées à une
séquence hétérologue codant pour une protéine (non
20 Notch) peuvent être construits. Un aspect spécifique
concerne une protéine chimérique comprenant un fragment
de Notch d'au moins six acides aminés.
Dans un autre aspect spécifique, le dérivé Notch
est un fragment de Notch comprenant une région
25 d'homologie avec une autre protéine toporythmique.
Telle qu'elle est utilisée ici, une région d'une
première protéine sera considérée comme "homologue" à
une deuxième protéine si la séquence d'acides aminés de
la région est d'au moins 30 % identique ou au moins
3 0 identique à 75 % ou impliquant des changements
conservatifs par rapport à une séquence de la deuxième
85
protéine d'un nombre égal d'acides aminés au nombre
contenu dans la région.
Les dérivés de serrate, Delta ou autres protéines
toporythmiques et les parties adhésives de ceux-ci
5 peuvent être produits par des procédés similaires à
ceux décrits ci-dessus.
5.9.1. DERIVES DE NOTCH CONTENANT UN OU PLUSIEURS
DOMAINES DE LA PROTEINE
10 Dans un aspect spécifique, la description propose
des produits thérapeutiques qui sont des dérivés de
Notch et des analogues, en particulier, les fragments
de Notch et les dérivés de ces fragments qui
comprennent un ou plusieurs domaines de la protéine
15 Notch, comprenant, de manière non restrictive, le
domaine extracellulaire, le domaine transmembranaire,
le domaine intracellulaire, la région associée à la
membrane, une ou plusieurs des répétitions de type EGF
(ELR) de la protéine Notch, les répétitions cdclO et
20 les répétitions Notch/lin-12. Dans des modes de
réalisation spécifiques, le dérivé Notch peut être
dépourvu de tout ou partie des ELR ou d'une ou
plusieurs autres régions de la protéine.
Dans un aspect spécifique, pour ce qui concerne
25 une protéine Notch d'une espèce autre que D.
melanogaster, de préférence, des fragments humains
comprenant des parties spécifiques de Notch sont ceux
comprenant des parties dans la protéine Notch
respective plus homologue aux fragments spécifiques de
3 0 la protéine Notch de Drosophila (par exemple, ELR11 et
ELR12).
86
5.9.2. DERIVES DE NOTCH OU AUTRES PROTEINES
TOPORYTHMIQUES QUI INDUISENT LA LIAISON AUX DOMAINES DE
PROTEINE TOPORYTHMIQUE ET LEURS INHIBITEURS
5 La description propose également des fragments de
Notch et des analogues ou dérivés de ces fragments qui
induisent la liaison aux protéines toporythmiques (et
donc sont nommés ici "adhésifs") et les séquences
d'acide nucléique codant pour les précédents.
10 On comprend également en tant que produits
thérapeutiques de la description, des fragments de
protéine toporythmique (par exemple, Delta, serrate) et
des analogues ou dérivés de ceux-ci qui induisent la
liaison hétérotypique à Notch (et sont donc nommés
15 "adhésifs"), et des séquences d'acide nucléique
relatives aux précédents.
On comprend également comme produits
thérapeutiques, des inhibiteurs (par exemple, des
inhibiteurs peptidiques) des interactions de protéine
20 toporythmique précédentes avec Notch.
La capacité à se lier à une protéine toporythmique
peut être démontrée par des essais d'agrégation in
vitro avec des cellules exprimant cette protéine
toporythmique ainsi que des cellules exprimant Notch ou
25 un dérivé de Notch (voir paragraphe 6) . En effet, la
capacité d'un fragment de protéine à se lier à une
protéine Notch peut être démontrée par la détection de
la capacité du fragment, lorsqu'il est exprimé sur la
surface d'une première cellule, à se lier à une
30 protéine Notch exprimée sur la surface d'une deuxième
cellule. Les inhibiteurs des interactions précédentes
87
peuvent être détectés par leur capacité à inhiber cette
agrégation in vitro.
Les séquences d'acide nucléique codant pour les
protéines toporythmiques ou les domaines adhésifs de
5 celles-ci à utiliser dans ces essais, peuvent être
isolées de sources humaines, porcines, bovines, félines,
aviaires, équines, canines ou d'insectes ainsi que de
primates et toute autre espèce dans laquelle des
homologues de gènes toporythmiques connus peuvent être
10 identifiés.
Dans un aspect spécifique, le fragment adhésif de
Notch est celui comprenant la partie de Notch la plus
homologue à ELR11 et 12, c'est-à-dire, les acides
aminés numéros 447 à 527 (SEQ ID N° : 14) de la
15 séquence Notch de Drosophila (voir figure 4) . Dans un
autre aspect spécifique, le fragment adhésif de Delta
induisant la liaison de Notch est celui comprenant la
partie de Delta la plus homologue à environ 1 à 23 0
acides aminés de la séquence Delta de Drosophila (SEQ
20 ID N° : 2) . Dans un aspect spécifique concernant un
fragment adhésif de Serrate, ce fragment est celui
comprenant la partie de serrate la plus homologue aux
acides aminés d'environ 82-283 ou 79 - 282 de la
séquence Serrate de Drosophila (voir figure 5 (SEQ ID
25 N° : 4)) .
En raison de la dégénérescence des séquences
codant pour un nucleotide, d'autres séquences ADN qui
codent substantiellement pour la même séquence d'acides
aminés que les séquences adhésives, peuvent être
3 0 utilisées dans la pratique de la présente restriction.
Celles-ci comprennent de manière non restrictive, des
88
séquences de nucleotides comprenant tout ou partie des
gènes Notch, Delta, ou Serrate qui sont modifiés par la
substitution de différents codons qui codent pour un
résidu d'acides aminés fonctionnellement équivalent
5 dans la séquence, produisant ainsi un changement
silencieux. De même, les fragments de protéine adhesive
ou leurs dérivés de la description comprennent, de
manière non restrictive, ceux contenant en tant que
séquence d'acides aminés primaires, tout ou partie de
10 la séquence d'acides aminés des domaines adhésifs
comprenant les séquences modifiées dans lesquelles des
résidus d'acides aminés fonctionnellement équivalents
sont substitués contre des résidus dans la séquence,
donnant un changement silencieux.
15 Les fragments adhésifs de protéines toporythmiques
et dérivés potentiels, analogues ou peptides associés
aux séquences de protéine toporythmique peuvent être
testés pour déterminer l'activité de liaison souhaitée,
par exemple, des essais d'agrégation in vitro décrits
20 dans les présents exemples. Les dérivés adhésifs ou
analogues adhésifs de fragments adhésifs de protéines
toporythmiques comprennent, de manière non restrictive,
les peptides qui sont substantiellement homologues aux
fragments adhésifs ou dont l'acide nucléique codant est
25 capable de s'hybrider à la séquence d'acide nucléique
codant pour les fragments adhésifs et lesdits peptides
et analogues de peptides ayant une activité de liaison
positive, par exemple testée un vitro par un essai
d'agrégation tel que décrit aux paragraphes d'exemples
3 0 ci-dessous. Ces dérivés et analogues sont pris en
compte en tant que produits thérapeutiques.
89
Les dérivés, analogues et peptides associés à la
protéine adhesive, de la description, peuvent être
produits par divers procédés connus dans l'art. Les
manipulations qui entraînent leur production peuvent se
5 produire au niveau du gène ou de la protéine (voir
paragraphe 5.6).
De plus, la séquence d'acide nucléique codant pour
l'adhésif peut être mutée in vitro ou in vivo -, et des
manipulations de la séquence adhesive peuvent également
10 être réalisées au niveau de la protéine (voir
paragraphe 5.6).
De plus, des analogues et peptides associés aux
fragments adhésifs peuvent être synthétisés
chimiquement.
15
5.10. ESSAIS DE PROTEINES NOTCH, DERIVES ET ANALOGUES
L'activité in vitro des protéines Notch, dérivés
et analogues et autres protéines toporythmiques qui se
lient à Notch, peut être testée par divers procédés.
20 Par exemple, dans un aspect, lorsque l'on teste la
capacité à se lier avec Notch de type sauvage ou à
concurrencer celui-ci dans la liaison à l'anticorps
anti-Notch, divers essais immunologiques connus dans
l'art peuvent être utilisés, comprenant, de manière non
25 restrictive, les systèmes d'essais compétitifs et non
compétitifs en utilisant des techniques telles que les
essais radio-immunologiques, ELISA (essai immuno-
enzymatique), les essais immunologiques en "sandwich",
les essais immuno-radiométriques, les réactions à la
3 0 précipitine par diffusion sur gel, des essais
d'immunodiffusion, des essais immunologiques in situ
90
(en utilisant de l'or colloïdal, des marqueurs
enzymatiques ou radio-isotopes, par exemple), des
western blots, des réactions de précipitation ; des
essais d'agglutination (par exemple, essais
5 d'agglutination du gel, essais d'hemagglutination), des
essais de fixation au complément, des essais
d'immunofluorescence, des essais à la protéine A et des
essais d'immunoélectrophorèse, etc. La liaison de
l'anticorps est détectée en détectant un marqueur sur
10 l'anticorps primaire. Dans un autre aspect, l'anticorps
primaire est détecté en détectant la liaison d'un
anticorps secondaire ou d'un réactif à l'anticorps
primaire. Dans un autre aspect, l'anticorps secondaire
est marqué. De nombreux moyens sont connus dans l'art
15 pour détecter la liaison dans un essai immunologique.
Dans un autre aspect, lorsque l'on teste la
capacité à induire une liaison à Notch, on peut
réaliser un essai d'agrégation in vitro tel que décrit
ci-dessous au paragraphe 6 ou 7 (voir également Fehon
20 et coll., 1990, Cell 61 : 523-534 ; Rebay et coll.,
1991, Cell 67 : 687-699).
Dans un autre aspect, lorsqu'un autre ligand de
Notch est identifié, on peut tester la liaison du
ligand, par exemple des essais de liaison bien connus
25 dans l'art. Dans un autre aspect, des corrélats
physiologiques de la liaison du ligand aux cellules
exprimant un récepteur de Notch (transduction de signal)
peuvent être testés.
Dans un autre aspect, dans des systèmes d'insectes
30 ou d'autres modèles, des études peuvent être réalisées
pour étudier l'effet phénotypique d'un mutant de Notch
91
qui est un dérivé ou un analogue de Notch de type
sauvage.
D'autres procédés seront connus de l'homme du
métier.
5
5.11. ANTICORPS ANTI-PROTEINES NOTCH, DERIVES ET
ANALOGUES
Selon un aspect de la description, des anticorps
et fragments contenant le domaine de liaison de ceux-ci,
10 dirigés contre Notch sont des produits thérapeutiques.
En conséquence, les protéines Notch, fragments ou
analogues ou dérivés de ceux-ci, en particulier des
protéines Notch humaines ou fragments de celles-ci
peuvent être utilisés comme immunogènes pour générer
15 des anticorps anti-protéine Notch. Ces anticorps
peuvent être polyclonaux, monoclonaux, chimériques, à
chaîne simple, des fragments Fab ou d'une bibliothèque
d'expression de Fab. Dans un aspect spécifique, des
anticorps spécifiques aux répétitions de type EGF 11 et
20 12 de Notch peuvent être préparés. Dans d'autres
aspects, des anticorps réactifs avec le domaine
extracellulaire de Notch peuvent être générés. Un
exemple de ces anticorps peut prévenir l'agrégation
dans un essai in vitro. Dans un autre aspect, des
25 anticorps spécifiques de Notch humain sont produits.
Divers procédés connus dans 1'art peuvent être
utilisés pour la production d'anticorps polyclonaux
contre une protéine Notch ou un peptide. Dans un aspect
particulier, les anticorps polyclonaux de lapin contre
30 un epitope de la protéine Notch humaine codée par une
séquence présentée sur la figure 10 ou 11, ou une sous-
92
séquence de ceux-ci peuvent être obtenus. Pour la
production d'anticorps, divers animaux hôtes peuvent
être immunisés par injection avec la protéine Notch
native ou une version synthétique ou un fragment de
5 celle-ci, comprenant de manière non restrictive, les
lapins, souris, rats, etc.
Divers adjuvants peuvent être utilisés pour
augmenter la réponse immunologique en fonction de
l'espèce hôte et comprenant, de manière non restrictive,
10 l'adjuvant de Freund (complet ou incomplet), des gels
minéraux tels que l'hydroxyde d'aluminium, les
substances tensioactives telles que la lysolécithine,
les polyols pluroniques, les polyanions, les peptides,
les emulsions huileuses, les hémocyanines de patelle,
15 le dinitrophénol et les adjuvants humains
potentiellement utiles tels que le BCG (bacille de
Calmette et Guérin) et Corynebacterium parvum.
Pour la préparation des anticorps monoclonaux
dirigés contre une séquence de protéine Notch, toute
20 technique qui assure la production de molécules
d'anticorps par des lignées cellulaires continues en
culture peut être utilisée. Par exemple, la technique
d'hybridome développée initialement par Kohler et
Mistein (1975, Nature, 256, 495-497) ainsi que la
25 technique du triome, la technique de l'hybridome à
lymphocytes B humains (Kozbor et coll., 1983,
Immunology Today 4, 72) et la technique de l'hybridome
EBV pour produire des anticorps monoclonaux humains
(Cole et coll., 1985 dans Monoclonal Antibodies and
30 Canceer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96).
93
Des fragments d'anticorps qui contiennent
1'idiotype (domaine de liaison) de la molécule peuvent
être générés par des techniques connues. Par exemple,
ces fragments comprennent, de manière non restrictive,
5 le fragment F(ab')2 qui peut être produit par digestion
à la pepsine de la molécule d'anticorps : les fragments
Fab' qui peuvent être générés en réduisant les ponts
disulfure du fragment F(ab')2 et les fragments Fab qui
peuvent être générés par traitement de la molécule
10 d'anticorps avec de la papaïne et un agent réducteur.
Dans la production d'anticorps, le criblage de
l'anticorps souhaité peut être accompli par des
techniques connues dans l'art, par exemple, ELISA
(essai immuno-enzymatique). Par exemple, pour choisir
15 des anticorps qui reconnaissent le domaine adhésif
d'une protéine Notch, on peut tester des hybridomes
générés pour un produit qui se lie à un fragment de
protéine contenant ce domaine. Pour le choix d'un
anticorps spécifique à Notch humain, on peut choisir
20 sur la base de la liaison positive à Notch humain et à
une absence de liaison à Notch de Drosophila.
En plus de l'utilité thérapeutique, les anticorps
précédents ont une utilité dans des essais
immunologiques de diagnostic décrits au paragraphe 5.6
25 ci-dessus.
Des procédés similaires à ceux décrits ci-dessus
peuvent être utilisés pour produire des produits
thérapeutiques qui sont des anticorps contre des
domaines d'autres protéines (en particulier des
30 protéines toporythmiques) qui se lient ou agissent
d'une autre façon avec Notch (par exemple, fragments
94
adhésifs de Delta ou Serrate). En particulier, ces
procédés peuvent être utilisés pour produire les
anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à
4.
5
6. DES DOMAINES DE NOTCH INDUISENT UNE LIAISON AVEC
DELTA
L'association intermoléculaire entre les produits
des gènes Notch et Delta a été détectée en étudiant les
10 effets de leur expression sur l'agrégation dans les
cellules de Schneider 2 (S2) de Drosophila (Fehon et
coll., 1990, Cell 61, 523-534). Une preuve directe des
interactions intermoléculaires entre Notch et Delta est
décrite dans ce document ainsi qu'un système d'essai
15 qui peut être utilisé dans la décomposition des
composants de cette interaction. Les cellules S2
cultivées de Drosophila normalement non adhésives qui
expriment Notch se lient spécifiquement de manière
dépendante du calcium aux cellules qui expriment Delta.
20 En outre, alors que les cellules qui expriment Notch ne
se lient pas les unes aux autres, les cellules qui
expriment Delta se lient les unes aux autres, suggérant
que Notch et Delta peuvent se concurrencer pour la
liaison à Delta à la surface cellulaire. Notch et Delta
25 forment des complexes solubles dans les détergents à la
fois dans des cellules cultivées et des cellules
embryonnaires, suggérant que Notch et Delta
interagissent directement au niveau moléculaire in
vitro et in vivo. Les analyses suggèrent que les
30 protéines Notch et Delta interagissent à la surface
cellulaire via leurs domaines extracellulaires.
95
Certains des exemples ci-dessous décrivent des
sujets qui sont hors du cadre des revendications et
sont décrits ici en tant qu'exemples de référence.
5 6.1. PROCEDES EXPERIMENTAUX
6.1.1. CONSTRUCTIONS D'EXPRESSION
Les constructions d'expression sont décrites par
Fehon et coll., 1990, Cell 61 : 523-534. En bref, Notch
codé par le minigène Mglla, une construction chimérique
10 d'ADNc/génomique (Ramos et coll., 1989, Genetics 123,
337-348) a été exprimé après insertion dans pRmHa-3
(Bunch et coll., 1988, Nucl. Acids Res. 16. 1043-1061).
Dans la construction obtenue, nommée pMtNMg, le
promoteur métallothionéine dans pRmHa-3 est fusionné
15 aux séquences Notch en commençant à 20 nucleotides en
amont du site de début de traduction.
La construction de Notch extracellulaire (ECN1) a
été dérivée d'un cosmide Notch (Ralos et coll., 1989,
Genetics 123, 337-348) et a une deletion interne des
20 séquences codant pour Notch des acides aminés 1790 à
2625 compris (Wharton et coll., 1985, Cell 43, 567-581)
et un décalage de cadre prévu qui produit une nouvelle
terminaison carboxyle de 59 acides aminés.
Pour la construction d'expression de Delta, l'ADNc
25 de DU (Kopczynski et coll., 1988, Genes Dev. 2. 1723-
1735 ; figure 1 ; SEQ ID N° : 1) qui comprend la
capacité codante complète de Delta a été inséré dans le
site EcoRI de pRmHa-3. Cette construction a été nommée
pMTDll.
30
96
6.1.2. PREPARATIONS D'ANTICORPS
La lignée de cellules d'hybridome C17.9C6 a été
obtenue à partir d'une souris immunisée avec une
protéine de fusion à base d'un fragment SalI-HindIII e
5 2,1 kb qui comprend des séquences codantes pour la
majeure partie du domaine intracellulaire de Notch
(acides aminés 1791-2504 ; Wharton et coll., 1985, Cell
43, 567-581). Le fragment a été sous-cloné dans pUR289
(Rüther et Muller-Hill, 1983, EMBO J. 2, 1791-1794)
10 puis transféré dans le vecteur d'expression pATH 1
(Dieckmann et Tzagoloff, 1985, J. Biol. Chem. 260,
1513-1520) en tant que fragment BglII-HindIII. La
protéine de fusion soluble a été exprimée, précipitée
par du (NH4)2S04 à 25 % remis en suspension dans de
15 l'urée 6 M et purifié par focalisation isoélectrique
préparatoire en utilisant un Rotofor (Bio-Rad) (pour
plus de détails, voir Fehon, 198 9, Rotofor Review, n° 7,
Bulletin 1518, Richmond, Californie : Bio-Rad
Laboratories).
20 Des antiserums polyclonaux de souris ont été
dirigés contre le domaine extracellulaire de Notch en
utilisant quatre fragments BstYI de 0,8 kb (acides
aminés 237-501 : Whartin et coll., 1985, Cell 43, 567-
581), 1,1 kb (acides aminés 501-868), 0,99 kb (acides
25 aminés 868-1200) et 1,4 kb (acides aminés 1465-1935) de
longueur qui allaient de la cinquième répétition de
type EGF sur le domaine transmembranaire, inséré
individuellement dans le cadre dans le vecteur
d'expression pGEX approprié (Smith et Johnson, 1988,
30 Gene 67, 31-40) . Des protéines de fusion ont été
purifiées sur des billes de glutathion - agarose
97
(SIGMA) . Des antiserums de souris et de rat ont été
précipités avec du (NH4)2S04 à 50 % et remis en
suspension dans du PBS (150 mM NaCl, 14 mM Na2HP04,
6 mM NaH2P04) avec du NaN3 à 0,02 %.
5 La lignée de cellules d'hybridome 201 a été
obtenue à partir d'une souris immunisée avec une
protéine de fusion qui comprend les séquences codantes
du domaine extracellulaire de Delta (Kopczynski et
coll., 1988, Genes Dev. 2. 1723-1735) comprenant les
10 séquences s'étendant de la quatrième à la neuvième
répétition de type EGF dans Delta (acides aminés 350-
529) .
Des antiserums polyclonaux de rat ont été obtenus
après immunisation avec un antigène dérivé de la même
15 construction de protéine de fusion. Dans ce cas, la
protéine de fusion a été préparée par lyse de cellules
induites par IPTG dans un tampon de SDS-Laemmli
(Carroll et Laughon, 1987 dans DNA Cloning, volume III,
D.M. Glover éd. (Oxford : IRL Press), pp. 89-111),
20 séparation de protéines par SDS-PAGE, excision de la
bande appropriée du gel et électro-élution de
l'antigène de la lame de gel pour utilisation en
immunisation (HArlow et Lane, 1988. Antibodies : A
Laboratory Manual (Colds Spring HArbor, New York : Cold
25 Spring Harbor Labporatory)).
6.1.3 CULTURE ET TRANSFECTION CELLULAIRE
La lignée de cellules S2 (Schneider, 1972, J.
Embryo 1. Exp. Morph. 27, 353-365) a été cultivée dans
30 un milieu M3 (préparé par Hazleton Co.) complété avec
2,5 mg/ml de BActo-Peptone (Difco), 1 mg/ml de TC
98
Yeastolate (Difco), 11 % de sérum bovin f?tal thermo-
inactivé (FCS) (Hyclone) et 100 U/ml de pénicilline -
100 ug/ml de streptomycine - 0,25 ug/ml de fungizone
(Hazleton). Les cellules cultivées en phase
5 logarithmique à ~ 2 x 106 cellules/ml ont été
transfectées avec 20 ug de co-précipité d'ADN-phosphate
de calcium dans 1 ml pour 5 ml de culture comme on l'a
décrit précédemment (Wigler et coll., 1979, Proc. Natl.
Acad. Sei. USA 78, 1373-1376), excepté le fait que le
10 tampon BAS (SIGMA) a été utilisé à la place du tampon
HEPES (Chen et Okayama, 1987. Mol. Cell. Biol. 7. 2745-
2752) . Après 16 à 18 h, les cellules ont été
transfectées dans des tubes centrifuges coniques,
agglomérés dans une centrifugeuse clinique à pleine
15 vitesse pendant 3 0 secondes, rincées une fois avec M de
volume de milieu frais complet', remises en suspension
dans leur volume d'origine de milieu complet et
replacées dans la fiole d'origine. On a ensuite laissé
reposer les cellules transfectées pendant 24 h avant
20 induction.
6.1.4. ESSAIS D'AGREGATION
L'expression des constructions de métallothionéine
de Notch et Delta a été induite par l'addition de CuS04
25 à 0,7 mM. Les cellules transfectées avec la
construction ECN1 ont été traitées de façon similaire.
Les cellules ont ensuite été mélangées, incubées dans
des conditions d'agrégation et leur capacité à
s'agréger en utilisant des antiserums spécifiques et la
30 microscopie par immunofluorescence a été déterminée
pour visualiser les l'expression des cellules.
99
Deux types d'essais d'agrégation ont été utilisés.
Dans le premier essai, un total de 3 ml de cellules (5-
10 x 106 cellules/ml) a été placé dans une fiole
Erlenmeyer de 25 ml et on l'a fait tourner à 40-50 t/m
5 sur un agitateur rotatif pendant 24 à 48 h à
température ambiante. Pour ces expériences, les
cellules ont été mélangées pendant 1 à 4 h une fois que
l'induction a commencé et l'induction s'est poursuivie
pendant toute la période d'agrégation. Dans le deuxième
10 essai, ~ 0,6 ml de cellules ont été placés dans un tube
Eppendorf de 0,6 ml (en laissant une petite bulle)
après une incubation pendant la nuit (12-16 h) à
température ambiante et en agitant légèrement pendant
l-2h à 4°C. Les expériences d'inhibition de
15 l'anticorps et de dépendance au Ca2+ ont été réalisées
en utilisant le dernier essai. Pour les expériences de
dépendance à Ca2+, les cellules ont tout d'abord été
recueillies et rincées dans une solution physiologique
équilibrée (BSS) avec 11 % de FCS (BSS-FCS ; le FCS a
20 été dialyse contre du NaCl 0,9 %, Tris 5 mM [pH 7,5])
ou du BSS-FCS dépourvu de Ca2+ contenant de 1 ' EGTA
10 mM (Snow et coll., 1989, Cell 59, 313-323) puis
remis en suspension dans le même milieu au volume
initial. Pour les expériences d'inhibition d'anticorps,
25 les cellules transfectées par Notch ont été recueillies
et rincées dans un milieu M3 puis traitées avant
agrégation dans un milieu M3 pendant 1 h à 4 °C à une
solution 1:250 de sérums immuns ou pré-immuns de
chacune des quatre souris immunisées avec les protéines
3 0 de fusion contenant des segments du domaine
100
extracellulaire de Notch (voir Préparation d'anticorps
ci-dessus).
6.1.5. IMMUNOFLUORESCENCE
5 Les cellules ont été recueillies par
centrifugation (300 t/m pendant 20 secondes dans un
tube de microcentrifugation Eppendorf) et fixées dans
des tubes Eppendorf de 0,6 ml avec 0,5 ml de
paraformaldehyde à 2 % préparé récemment dans du PBS
10 pendant 10 min à température ambiante. Après fixation,
les cellules ont été recueillies par centrifugation,
rincées deux fois dans du PBS et colorées pendant 1 h
dans un anticorps primaire dans du PBS avec 0,1 % de
saponine (SIGMA) et 1 % de sérum de chèvre normal
15 (Pocono Rabbit Farm, Canadensis, PA) . Des surnageants
d'anticorps monoclonal ont été dilués à 1:10 ou des
sérums de rat ont été dilués à 1:1000 pendant cette
étape. Les cellules ont ensuite été rincées une fois
dans du PBS et colorées pendant 1 h dans des anticorps
20 secondaires spécifiques (anti-souris de chèvre et anti-
rat de chèvre à double marquage, Jackson Immunoresearch)
dans du sérum de chèvre PBS-saponine-normal. Après
cette incubation, les cellules ont été rincées deux
fois dans du PBS et montées sur des lames dans 90 % de
25 glycerol, 10 % de Tris 1 M (pH 8,0) et 0,5 % de n-
propyl-gallate. Les cellules ont été visualisées sous
épifluorescence sur un microscope Leitz Orthoplan 2.
Des micrographies confocales ont été prises en
utilisant le système Bio-Rad MRC 500 relié à un
30 microscope à composé Zeiss Axiovert. Les images ont été
recueillies en utilisant les jeux de filtres BHS et GHS,
101
alignés en utilisant le programme ALIGN et fusionnés à
l'aide de MERGE. Le transpercement fluorescent du vert
dans le canal rouge a été réduit en utilisant le
programme BLEED (tous les logiciels sont fournis par
5 Bio-Rad). Les photographies ont été obtenues
directement à partir de l'écran d'ordinateur en
utilisant un film Kodak Ektar 125.
6.1.6. LYSATS CELLULAIRES, IMMUNOPRECIPITATIONS ET
10 WESTERN BLOTS
Des lysats détergents non dénaturants de culture
tissulaire et d'embryons Canton-S de type sauvage ont
été préparés sur glace dans ~ 10 vol. de cellules de
tampon de lyse (300 mM NaCl, Tris 50 mM [pH 8,0], 0,5 %
15 NP-40, 0,5 % désoxycholate, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM)
avec du fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM (PMSF)
et du fluorophosphate de diisopropyle dilué à 1:2500
comme inhibiteurs de la protease. Les lysats ont été
triturés séquentiellement en utilisant des aiguilles
20 18G, 21G et 25G fixées à des seringues de tuberculine
1 cm3 puis centrifugées à pleine vitesse dans un tube
microfuge pendant 10 min à 4 °C pour éliminer le
matériau insoluble. L'immunoprécipitation a été
réalisée en ajoutant ~ 1 ug d'anticorps (1 à 2 ul
25 d'antisérum polyclonal) à 250-500 ul de lysat
cellulaire et en incubant pendant 1 h à 4 °C en agitant.
A ce mélange, on a ajouté 15 ug d'anticorps anti-souris
de chèvre (Jackson Immunoresearch : ces anticorps
reconnaissent à la fois les IgG de souris et de rat) et
3 0 on a laissé incuber pendant 1 h à 4 °C en agitant. Puis
on a ajouté 100 ul de bactérie de Staphylococcus aureus
102
fixée (Staph A) (Zysorbin, Zymed ; remis en suspension
selon les instructions du fabricant) qui a ensuite été
recueilli, lavé cinq fois dans un tampon de lyse et
incubé pendant encore une heure. Les complexes Staph A
5 - anticorps ont ensuite été agglomérés par
centrifugation et lavés trois fois dans un tampon de
lyse suivi de deux lavages de 15 min dans un tampon de
lyse. Après avoir été transféré dans un nouveau tube,
le matériau précipité a été remis en suspension dans
10 50 ul de tampon d'échantillon de SDS-PAGE, porté à
ebullition immédiatement pendant 10 min, passé sur des
gels de gradient de 3 % à 15 %, buvardé sur
nitrocellulose et détecté en utilisant des anticorps
monoclonaux et des anticorps secondaires anti-souris de
15 chèvre conjugués à HRP comme on l'a décrit précédemment
(Johansen et coll., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440).
Pour les échantillons de protéine cellulaire totaux
utilisés sur les Western blots, les cellules ont été
recueillies par centrifugation, lysées dans 10 vol. de
20 cellules du tampon d'échantillon qui contenait du PMSF
1 mM et portées immédiatement à ebullition.
6.2. RESULTATS
6.2.1. EXPRESSION DE NOTCH ET DE DELTA DANS LES
25 CELLULES CULTIVEES
Pour détecter les interactions entre Notch et
Delta, nous avons examiné le comportement des cellules
exprimant ces protéines sur leurs surfaces en utilisant
un essai d'agrégation. Nous avons choisi la lignée de
30 cellules S2 (Schneider, 1972, J. Embryo1. Exp. Morph.
27, 353-365) pour ces études. Les cellules S2 expriment
10
103
un message de Notch aberrant et aucun Notch détectable
dû à un réarrangement de 1'extrémité 5' de la séquence
codant pour Notch. Ces cellules n'expriment pas non
plus de Delta détectable.
Les résultats de Western blot et l'analyse par
immunofluorescence ont clairement montré que les
constructions de Notch et Delta stimulent l'expression
des protéines de tailles attendues et la localisation
subcellulaire.
6.2.2. CELLULES EXPRIMANT L'AGREGAT DE NOTCH ET DELTA
Un simple essai d'agrégation a été utilisé pour
détecter les interactions entre Notch et Delta exprimés
sur la surface des cellules S2.
15 Les cellules S2 en culture en phase logarithmique
ont été transfectées séparément avec la construction du
promoteur de métallothionéine de Notch ou Delta. Après
induction avec du CuS04, les cellules transfectées ont
été mélangées en nombres égaux et elles se sont
20 agrégées pendant la nuit à température ambiante (pour
plus de détails, voir les Procédés expérimentaux,
paragraohe 6.1). En variante, dans certaines
expériences destinées à réduire l'activité métabolique,
les cellules ont été mélangées délicatement à 4 °C
25 pendant 1 à 2 h. Pour déterminer si des agrégats se
sont formés, les cellules ont été traitées pour
microscopie par fluorescence en utilisant des anticorps
spécifiques pour chaque produit de gène et des
anticorps secondaires fluorescents marqués de façon
30 différente. L'expression des cellules a généralement
constitué moins de 5 % de la population cellulaire
104
totale car on a utilisé des transformants provisoires
au lieu de transformants stables. Les cellules
restantes n'ont pas exprimé une protéine donnée ou
l'ont exprimée à des niveaux trop faibles pour la
5 détection par microscopie par immunofluorescence. Comme
témoins, nous avons réalisé des agrégations avec
uniquement un type unique de cellule transfectée.
Les résultats (Fehon et coll. 1990, Cell 61 : 523-
534) ont montré qu'alors que les cellules exprimant
10 Notch (Notch"1") seules ne formaient pas d'agrégats dans
l'essai, les cellules exprimant Delta (Delta+) en
formaient. La tendance des cellules Delta"1" à s'agréger
était apparente même dans les échantillons témoins non
agrégés alors que des amas cellulaires de 4 à
15 8 cellules qui provenaient probablement de l'adhérence
entre les cellules s?urs mitotiques se sont produits
couramment. Toutefois, les amas étaient plus courants
après incubation dans des conditions d'agrégation (par
exemple, 19 % des cellules Delta"1" dans les agrégats
20 avant incubation vs 37 % des cellules Delta"1" dans les
agrégats après incubation) indiquant que les cellules
Delta"1" sont capables de former des contacts stables les
unes avec les autres dans cet essai.
Contrastant remarquablement par rapport aux
25 expériences témoins avec les cellules Notch"1" seules,
l'agrégation de mélanges de cellules Notch+ et Delta"1" a
entraîné la formation d'amas allant jusqu'à 20 cellules
ou plus. La fraction de cellules d'expression dans les
amas de quatre cellules colorées ou plus après 24 h
3 0 d'agrégation allait de 32 % à 54 % dans les mélanges de
cellules Notch"1" et Delta"1". Cet intervalle était
105
similaire à celui observé pour les cellules Delta"1"
seules (37 % - 40 %) mais très différent de celui
observé pour les cellules Notch+ seules (uniquement 0 %
à 5 %) . Bien que quelques amas qui consistaient
5 uniquement en cellules Delta"1" aient été trouvés, les
cellules Notch"1" n'ont jamais été observées dans les
amas de plus de quatre à cinq cellules à moins que des
cellules Delta"1" n'aient également été présentes. Dans
ce cas également, toutes les cellules dans ces amas
10 n'exprimaient ni Notch ni Delta même si les cellules
transfectées ne constituaient qu'une petite fraction de
la population de cellules totale. A 48 h, le degré
d'agrégation est apparu supérieur (63 % à 71 %) ,
suggérant que cette agrégation n'avait pas encore
15 atteint un maximum après 24 h dans ces conditions. De
même, les cellules co-transfectées par les
constructions de Notch et Delta (de sorte que toutes
les cellules transfectées expriment les deux protéines)
se sont agrégées de manière similaire sans les mêmes
20 conditions expérimentales.
L'implication de Notch dans le processus
d'agrégation a été testée directement en examinant
l'effet d'un mélange d'antiserums polyclonaux dirigés
contre des protéines de fusion qui couvraient
25 pratiquement le domaine extracellulaire entier de Notch
sur l'agrégation (voir Processus expérimentaux,
paragraphe 6.1). Pour minimiser les artefacts
susceptibles de se produire en raison d'une réponse
métabolique à la redistribution d'antigènes de surface,
3 0 le traitement par anticorps et l'essai d'agrégation ont
été réalisés à 4 °C dans ces expériences. Les cellules
106
Notch"1" ont été incubées avec des sérums de souris pré-
immuns ou immuns pendant 1 h, les cellules Delta"1" ont
été ajoutées et l'agrégation a été réalisée pendant 1 à
2 h. Alors que les cellules Notch"1" prétraitées avec des
5 sérums pré-immuns se sont agrégées avec les cellules
Delta"1" (dans l'une des trois expériences, 23 % des
cellules Notch"1" étaient dans les agrégats cellulaires
Notch"1" - Delta"1") , celles traitées avec des sérums
immuns ne l'ont pas fait (seules 2 % des cellules
10 Notch"1" se trouvaient dans les agrégats) . Ce résultat
suggère que le domaine extracellulaire de Notch était
nécessaire pour l'agrégation des cellules Notch"1"
Delta"1".
15 6.2.3. L'AGREGATION INDUITE PAR NOTCH-DELTA EST
CALCIUM-DEPENDANTE
La capacité des cellules d'expression à s'agréger
en présence ou en l'absence d'ions Ca2+ a été testée
pour déterminer si la présence de Ca2+ est nécessaire
20 pour l'agrégation de Notch-Delta. Pour minimiser les
effets non spécifiques possibles dus aux réponses
métaboliques à l'élimination de Ca2+, ces expériences
ont été réalisées à 4 °C. Les résultats ont clairement
démontré une dépendance de 1'agrégation induite par
25 Notch-Delta sur le Ca2+ exogène.
6.2.4. NOTCH ET DELTA INTERAGISSENT DANS UNE CELLULE
UNIQUE
La question de savoir si Notch et Delta sont
30 associés dans la membrane d'une cellule qui exprime les
deux protéines a été posée en étudiant les
107
distributions de Notch et de Delta dans les cellules
co-transfectées. Pour tester si la co-localisation
observée était co-incidente ou représentait une
interaction stable entre Notch et Delta, des cellules
5 vivantes ont été traitées avec un excédent d'antisérum
anti-Notch polyclonal. Ce traitement a entraîné une
"redistribution" de Notch sur la surface de cellules
d'expression en éléments individuels détectés par
immunofluorescences. Il y avait une corrélation
10 distincte entre les distributions de Notch et de Delta
sur les surfaces de ces cellules après ce traitement,
indiquant que ces protéines sont associées dans la
membrane.
15 6.2.5. LES INTERACTIONS AVEC DELTA NE NECESSITENT PAS
LE DOMAINE INTRACELLULAIRE DE NOTCH
En plus d'un grand domaine extracellulaire qui
contient des répétitions de type EGF, Notch a un
domaine intracellulaire (IC) mesurable de ~ 94 0 acides
20 aminés. Le domaine IC comprend un site de
phosphorylation (Kidd et coll., 1989, Genes Dev. 3,
1113-1129), un domaine de liaison de nucleotide putatif,
un allongement de polyglutamine (Wharton et coll., 1985,
Cell 43, 567-581 : Kidd et coll., 1986, Mol. Cell Biol.
25 6, 3094-3108) et des séquences homologues à celles du
gène cdclO de levure qui est impliqué dans le contrôle
du cycle cellulaire dans la levure (Breeden et Nasmyth,
1987, Nature 329, 651-654). Une variante de
construction de Notch a été utilisée à partir de
30 laquelle des séquences codantes pour ~ 835 acides
aminés du domaine IC, comprenant toutes les
108
caractéristiques structurales mentionnées ci-dessus,
ont été supprimées (laissant 25 acides aminés proximaux
à la membrane et une nouvelle terminaison carboxyle de
59 acides aminés ; voir Procédés expérimentaux).
5 Dans des essais d'agrégation, les cellules qui
exprimaient la construction ECN1 ont formé de façon
constante des agrégats avec les cellules Delta"1" mais
non avec elles-mêmes, tout comme on l'a observé pour
les cellules qui exprimaient Notch intact. Des bandes
10 nettes de coloration de ECN1 ont été observées dans les
régions de contact avec les cellules Delta*, indiquant
à nouveau une localisation de ECN1 dans les régions de
contact entre les cellules. Pour tester les
interactions dans la membrane, des expériences de
15 redistribution conjointes d'antigène de surface ont été
réalisées en utilisant des cellules co-transfectées
avec les constructions de ECN1 et Delta. Comme on l'a
observé pour Notch intact, lorsque ECN1 a été
redistribué en utilisant des antiserums polyclonux
20 contre le domaine extracellulaire de Notch, ECN1 et
Delta étaient colocalisés au niveau de la surface
cellulaire. Ces résultats démontrent que les
interactions observées entre Notch et Delta dans la
membrane ne nécessitent pas la partie supprimée du
25 domaine IC de Notch et sont par conséquence
probablement induites par le domaine extracellulaire.
6.2.6. NOTCH ET DELTA FORMENT DES COMPLEXES
INTERMOLECULAIRES SOLUBLES DANS LES DETERGENTS
30 Les résultats précédents ont mis en évidence des
interactions moléculaires entre Notch et Delta présents
109
dans la même membrane et entre ces protéines exprimées
sur différentes cellules. Un autre test de ces
interactions concerne le fait que ces protéines
seraient co-précipitées à partir d'extraits de
5 détergents non dénaturants de cellules qui expriment
Notch et Delta. Si Notch et Delta forment un complexe
intermoléculaire stable entre ou dans les cellules, il
doit alors être possible de précipiter les deux
protéines des extraits cellulaires en utilisant des
10 antiserums dirigés contre l'une de ces protéines. Cette
analyse a été réalisée par immunoprécipitation de Delta
avec des antiserums polyclonaux de lysats de NP-
4 0/désoxycholate (voir Procédés expérimentaux) de
cellules cotransfectées avec les constructions Notch et
15 Delta que l'on a laissé s'agréger pendant la nuit ou
d'embryons de type sauvage de 0 à 24 h.
La coprécipitation de Notch a été détectée dans
des immunoprécipitats de Delta à partir de cellules co-
transfectées et d'embryons. Toutefois, la
20 coprécipitation de Notch semble être présente en
quantités beaucoup plus petites que Delta et a donc été
difficile à détecter. Le fait que 1'immunoprécipitation
de Delta entraîne la coprécipitation de Notch constitue
une preuve directe que ces deux domaines forment des
25 complexes intermoléculaires stables dans les cellules
S2 transfectées et dans les cellules embryonnaires.
6.3. DISCUSSION
L'utilisation d'un essai d'agrégation in vitro qui
3 0 utilise des cellules S2 normalement non adhésives a
110
montré que les cellules qui expriment Notch et Delta
adhèrent spécifiquement les unes aux autres.
7. LES REPETITIONS 11 ET 12 EGF DE NOTCH SONT
5 NECESSAIRES ET SUFFISANTES POUR L'AGREGATION INDUITE
PAR NOTCH-DELTA
Le même essai d'agrégation a été utilisé comme on
le décrit au paragraphe 6, conjointement avec des
mutants de deletion de Notch pour identifier les
10 régions dans le domaine extracellulaire de Notch
nécessaires pour les interactions avec Delta. Cette
mise en évidence montre que les répétitions EGF de
Notch sont directement impliquées dans cette
interaction et que seules deux (ELR 11 et 12) des
15 36 répétitions de EGF semblent nécessaires. Ceux deux
répétitions d'EGF sont suffisantes pour la liaison à
Delta et la dépendance au calcium de l'agrégation
induite par Notch-Delta s'associe également à ces deux
répétitions. Enfin, les deux répétitions d'EGF
20 correspondantes de l'homologue Xenopus de Notch
induisent également l'agrégation avec Delta, impliquant
que non seulement, la structure de Notch a été
conservée de façon évolutive mais également sa fonction.
Ces résultats suggèrent que le domaine extracellulaire
25 de Notch est étonnamment modulaire et pourrait
potentiellement se lier à diverses protéines en plus de
Delta (voir Rebay et coll., 1991, Cell 67 : 687-699).
Ill
7.1. PROCEDES EXPERIMENTAUX
7.1.1. CONSTRUCTIONS D'EXPRESSION
Les constructions décrites sont toutes dérivées de
la construction d'expression Notch de longueur totale
5 #1 pMtNMg (voir paragraphe 6, ci-dessus) et ont été
réalisées comme cela est décrit (Rebay et coll., 1991,
Cell 67 : 687-699) .
7.1.2. CULTURE ET TRANSFECTION CELLULAIRE
10 La lignée de cellules S2 de Drosophila a été
cultivée et transfectée comme on l'a décrit au
paragraphe 6 ci-dessus. La lignée de cellules S2
transformée de façon stable, exprimant Delta, L-49-6-7
(établie aimablement par L. Cherbas) a été cultivée
15 dans un milieu M3 (préparé par Hazleton Co.) complété
avec 11 % de sérum f?tal bovin thermo-inactivé (FCS)
(Hyclone) , 100 U/ml de pénicilline-100 ug/ml de
streptomycine - 0,25 ug/ml de fungizone (Hazleton), 2 x
10"7 M methotrexate, hypoxanthine 0,1 mM et thymidine
20 0,016 mM.
7.1.3. ESSAIS D'AGREGATION ET IMMUNOFLUORESCENCE
Les essais d'agrégation et les expériences de
dépendance au Ca"1"1" étaient tels que décrits ci-dessus,
25 paragraphe 6. Les cellules ont été colorées avec
l'anticorps monoclonal anti-Notch 9C6.C17 et des
antiserums polyclonaux de rat anti-Delta (détails
décrits au paragraphe 6 ci-dessus). L'expression de
surface des constructions Notch dans des cellules non
30 imperméabilisées a été testée en utilisant des
antiserums polyclonaux de rat contre le fragment BstYl
112
de 0,8 kb (acides aminés 237-501 ; Wharton et coll.
1985, Cell 43, 567-581) du domaine extracellulaire de
Notch. Les cellules ont été visualisées sous
épifluorescence sur un microscope Leitz Orthoplan 2.
5
7.2. RESULTATS
7.2.1. LES REPETITIONS EGF 11 ET 12 DE NOTCH SONT
NECESSAIRES POUR L'AGREGATION INDUITE PAR NOTCH - DELTA
Une analyse de suppression complète du domaine
10 extracellulaire de la protéine Notch a été réalisée, et
il s'est avéré (cf ci-dessus, paragraphe 6 ; Fehon et
coll., 1990, Cell 61 : 523-534) être impliqué dans les
interactions Notch-Delta pour identifier le domaine
précis de Notch induisant ces interactions. La capacité
15 des cellules transfectées avec les diverses
constructions de deletion à interagir avec Delta a été
testée en utilisant l'essai d'agrégation décrit au
paragraphe 6. En bref, des constructions de deletion de
Notch ont été transfectées provisoirement dans des
20 cellules S2 de Drosophila, induites avec CuS04 puis
agrégées pendant la nuit à température ambiante avec
une petite quantité de cellules de la lignée de
cellules exprimant Delta transformée de façon stable,
L49-6-7 (Charbas), donnant une population constituée
25 habituellement de ~ 1 % de cellules exprimant Notch et
~ 5 % de cellules exprimant Delta, les cellules
restantes n'exprimant aucune protéine.
Les dessins schématiques des constructions testées
et les résultats des expériences d'agrégation sont
3 0 présentés sur la figure 2. Pour déterminer le degré
d'agrégation, les cellules ont été colorées avec des
113
antiserums spécifiques à chaque produit de gène et
examinées par microscopie par immunofluorescence. Les
agrégats ont été définis en tant qu'amas de quatre
cellules ou plus contenant à la fois des cellules
5 exprimant Notch et Delta et les valeurs présentées sur
la figure 2 représentent le pourcentage de toutes les
cellules exprimant Notch trouvées dans les amas. Tous
les chiffres indiquent le résultat moyen d'au moins
deux expériences de transfection séparées dans
10 lesquelles au moins 100 unités de cellules exprimant
Notch (les cellules simples ou les amas) ont été
testées.
Les constructions initiales (#2 DSph et #3 ÀCla)
ont supprimé de grandes parties des répétitions EGF.
15 Leur incapacité à favoriser l'agrégation Notch - Delta
a suggéré que les répétitions EGF de Notch étaient
impliquées dans l'interaction avec Delta. Une série de
six sites de restriction Call dans le cadre a été
utilisée pour disséquer encore la région entre les
20 répétitions EGF 7 et 30. Compte tenu de 1'homologie de
séquence entre les répétitions, cinq des sites Clal
étaient au même endroit relatif dans la répétition EGF,
juste après la troisième cysteine, alors que le sixième
site se situe juste avant la première cysteine de la
25 répétition EGF 31 (figure 3). Par conséquent, en
réalisant une digestion partielle de Clal puis une
nouvelle ligature, des deletions ont été obtenues, qui
ont non seulement conservé le cadre de lecture ouvert
de la protéine Notch mais de plus, ont fréquemment
3 0 conservé l'intégrité structurale et conservé
l'espacement, au moins théoriquement, des trois ponts
114
disulfure dans les répétitions EGF chimériques
produites par la nouvelle ligature (figure 2,
constructions #4-14). Malheureusement, le site Clal le
plus en 3' était résistant à la digestion alors que le
5 site Clal le plus en 3' suivant a été rompu entre les
répétitions EGF 30 et 31. Par conséquent, lorsque
divers fragments de digestion Clal ont été réinsérés
dans le cadre de la digestion Clal complète
(construction #3 ACla), la structure globale des
10 répétitions EGF était apparemment ininterrompue au
niveau de la jonction 3'.
Plusieurs points autour de cette série de
construction méritent d'être soulignés. En premier lieu,
l'élimination de la rupture du fragment de restriction
15 Clal dans les répétitions EGF 9 et 17 (constructions #8
AEGF9-17) a annulé l'agrégation avec Delta alors que la
réinsertion de cet élément dans la construction {#3
ACla qui est dépourvue des répétitions EGF 7-30 a
restauré l'agrégation, grossièrement, aux niveaux du
20 type sauvage (construction #13 ACla + EGF9-17),
suggérant que les répétitions EGF 9 à 17 contiennent
des séquences importantes pour la liaison à Delta.
Ensuite, toutes les constructions de cette série (#4-14)
étaient conformes à la cartographie du site de liaison
25 jusqu'aux répétitions EGF 9 à 17. Les constructions
d'expression contenant ces répétitions (#6, 7, 9, 10,
13) ont favorisé les interactions Notch-Delta alors que
les constructions dépourvues de ces répétitions (#4, 5,
8, 11, 12, 14) ne les ont pas favorisées. Pour
30 confirmer le fait que cette incapacité à s'agréger avec
des cellules Delta n'était pas seulement due à une
115
incapacité de la protéine Notch mutagénisée à atteindre
la surface cellulaire, mais .reflétait en fait la
deletion du site de liaison nécessaire, l'expression de
surface cellulaire de toutes les constructions a été
5 testée par coloration par immunofluorescence des
cellules vivantes transfectées avec des anticorps
spécifiques du domaine extracellulaire de Notch. Toutes
les constructions incapables d'induire des interactions
Notch-Delta ont produit une protéine qui est apparue
10 comme étant exprimée normalement à la surface
cellulaire. Enfin, bien que l'essai d'agrégation ne
soit pas quantitatif, deux constructions qui
contenaient les répétitions EGF 9-17, #9 AEGF17-26 ou,
de façon le plus remarquable, #10 AEGF26-30, se sont
15 agrégées à un niveau apparemment inférieur. Les
cellules transfectées avec les constructions #9 AEGF17-
26 et 10 AEGF26-30 présentaient considérablement moins
de coloration de surface que la normale, bien que les
cellules fixées et perméabilisées réagissent avec le
20 même anticorps coloré normalement, indiquant que les
epitopes reconnus par les antiserums n'avaient pas été
simplement supprimés. En comparant le pourcentage de
cellules transfectées dans les populations de cellules
perméabilisées ou vivantes, on a observé qu'en gros,
25 50 % des cellules transfectées pour la construction #9
AEGF17-26 et 10 % pour la construction #10 AEGF26-30
ont produit une protéine détectable à la surface
cellulaire. Ainsi, ces deux constructions ont produit
des protéines qui n'ont souvent pas pu atteindre la
3 0 surface cellulaire, peut-être à cause d'un défaut de
repliement, réduisant ainsi, sans toutefois abolir, la
116
capacité des cellules transfectées à s'agréger avec des
cellules exprimant Delta.
Une fois cartographie le site de liaison aux
répétitions EGF 9 à 17, d'autres expériences (Rebay et
5 coll., 1991, Cell 67 : 687-699) ont révélé que la
répétition EGF 14 de Notch n'était pas impliquée dans
les interactions avec Delta modélisé par l'essai de
culture tissulaire.
Pour poursuivre la cartographie du domaine de
10 liaison avec les répétitions EGF 9 à 17, des amorces
d'oligonucleotides spécifiques et la technique de PCR
ont été utilisées pour générer plusieurs sous-fragments
de cette région. Trois constructions chevauchantes, #16,
17 et 18 ont été produites, seule l'une d'entre elle,
15 #16 ACla + EGF9-13, une fois transf ectée dans les
cellules S2, ayant permis l'agrégation avec les
cellules Delta. La construction #19 ACla + EGF (10-13)
qui est dépourvue de la répétition EGF 9, a défini
encore les répétitions de EGF 10-13 comme région
20 nécessaire pour les interactions Notch - Delta.
Les constructions #20-24 représentaient des
tentatives de rupture de ce domaine, même en utilisant
encore la même stratégie de PCR (voir figure 13) . Les
constructions #20 ACla + EGF (11-13) dans lesquelles la
25 répétition EGF 12 est la seule répétition entière
ajoutée et #21 ACla + EGF (10-12) dans laquelle la
répétition EGF 11 est la seule répétition entière
ajoutée, n'ont pas pu induire l'agrégation, suggérant
que la présence de la répétition EGF 11 ou 12 seule
30 n'était pas suffisante pour les interactions Notch-
Delta. Toutefois, comme la jonction de ligature 3' de
117
ces constructions a interrompu la structure globale des
répétitions EGF, il était possible qu'une courte zone
"tampon" soit nécessaire pour permettre à la répétition
cruciale de fonctionner normalement. Ainsi par exemple,
5 dans la construction #19 ACla + EGF (10-13), la
répétition EGF 12 pourrait ne pas être impliquée
directement dans la liaison à Delta mais en revanche,
pourrait contribuer à la quantité minimale de séquence
tampon nécessaire pour protéger la structure de la
10 répétition EGF 11, permettant ainsi des interactions
avec Delta. Les constructions #22-24 ont répondu à ce
problème. Les constructions #22 ACla + EGF (10-11) qui
n'induisait pas d'agrégation, et #23 ACla + EGF (10-12)
qui l'induisait, ont suggéré à nouveau que les deux
15 répétitions 11 et 12 sont nécessaires alors que la
séquence flanquante de la répétition 13 ne l'est
clairement pas. Enfin, la construction #24 ACla + EGF
(11-12), bien qu'elle soit à présent potentiellement
rompue structurellement au niveau de la jonction 5', a
20 démontré de façon convaincante que les séquences de la
répétition EGF 10 ne sont pas déterminantes. Ainsi, sur
la base des données entièrement conformes de
24 constructions, les répétitions EGF 11 et 12 de Notch
définissent conjointement la plus petite unité
25 fonctionnelle pouvant être obtenue à partir de cette
analyse qui contienne les sites nécessaires pour la
liaison à Delta dans les cellules S2 transfectées.
118
7.2.2. LES REPETITIONS EGF 11 ET 12 DE NOTCH SONT
SUFFISANTES POUR L'AGREGATION INDUITE PAR NOTCH - DELTA
La grande deletion Clal dans laquelle des
fragments de PCR ont été insérés (#3, ACla) conserve en
5 gros 1/3 des 3 6 répétitions EGF d'origine ainsi que les
trois répétitions Notch/lin-12. Alors que celles-ci ne
sont clairement pas suffisantes pour favoriser
l'agrégation, il est possible qu'elles forment un cadre
nécessaire dans lequel des répétitions EGF spécifiques
10 peuvent interagir avec Delta. Pour tester si seules
quelques répétitions EGF étaient en fait suffisantes
pour favoriser l'agrégation, deux constructions ont été
conçues, #25 AEGF qui a supprimé l'ensemble des
3 6 répétitions EGF excepté pour ce qui concerne les
15 deux premiers tiers de la répétition 1, et #3 0 AECN qui
a supprimé la partie extracellulaire entière de Notch
excepté pour ce qui concerne le premier tiers de la
répétition EGF 1 et ~ 35 acides aminés juste avant le
domaine transmembranaire. Les fragments qui avaient
20 induit l'agrégation Notch - Delta dans le fond de la
construction #3 ACla, lorsqu'ils sont insérés dans la
construction #25 AEGF, ont pu à nouveau favoriser les
interactions avec Delta (constructions #26-30). Les
constructions analogues (#31, 32) dans laquelle les
25 répétitions Notch/lin-12 étaient également absentes,
ont là encore induit avec succès l'agrégation Notch -
Delta. Par conséquent, les répétitions EGF 11 et 12
semblent fonctionner en tant qu'unités modulaires
indépendantes qui sont suffisantes pour induire des
3 0 interactions Notch - Delta dans les cellules S2, même
119
en l'absence de la majeure partie du domaine
extracellulaire de Notch.
7.2.3. LES REPETITIONS EGF 11 ET 12 DE NOTCH CONSERVENT
5 LA DEPENDANCE AU CALCIUM DE L'AGREGATION INDUITE PAR
NOTCH - DELTA
La capacité des cellules exprimant certaines
constructions de deletion à s'agréger avec les cellules
exprimant Delta a été examinée en présence ou en
10 l'absence d'ions Ca"1"1". La dépendance au calcium de
1'interaction a été conservée même dans la construction
la plus petite, ce qui est conforme au fait que les
constructions minimales contenant les répétitions EGF
11 et 12 se lient à Delta de manière similaire à celle
15 de Notch de longueur totale.
7.2.4. LA FONCTION DE LIAISON DELTA DES REPETITIONS EGF
11 ET 12 DE NOTCH EST CONSERVEE DANS L'HOMOLOGUE DE
NOTCH DE XENOPUS
20 Les amorces de PCR basées sur la séquence Notch de
Xenopus (Coffman et coll., 1990, Science 249, 1438-1441)
ont été utilisées pour obtenir un fragment de ~ 350 pb
d'une bibliothèque d'ADNc de stade 17 de Xenopus qui
comprend les répétitions EGF 11 et 12 flanquées par la
25 moitié des répétitions 10 et 13 d'un côté ou de l'autre.
Ce fragment a été clone dans la construction #3 ACla et
trois clones dépendants ont été testés pour déterminer
la capacité à interagir avec Delta dans l'essai
d'agrégation de culture cellulaire. Deux des clones,
30 #33a&bACla + XEGF (10-13) , une fois transformés dans
les cellules S2, ont pu induire des interactions Notch
120
- Delta à un niveau grossièrement équivalent à celui de
la construction Notch analogue #19ACla + XEGF (10-13)
de Drosophila et là encore, de manière calcium-
dépendante (tableau III). Toutefois, le troisième clone
5 #33ACla + XEGF (10-13) n'a pas induit d'interactions
Notch-Delta bien que la protéine ait été exprimée
normalement à la surface cellulaire comme on peut en
juger par la coloration de cellules non perméabilisées
vivantes. La comparaison de séquence du produit de PCR
10 de Xenopus dans les constructions #33a et 33c a révélé
une mutation faux-sens entraînant un changement d'une
leucine contre une proline (acide aminé #453, Coffman
et coll., 1990, Science 249, 1438-1441) dans la
répétition EGF 11 de la construction #33c. Bien que ce
15 résidu ne soit pas conservé entre Notch de Drosophila
et de Xenopus (figure 8), l'introduction d'un résidu
proline pourrait facilement rompre la structure de la
répétition EGF et donc, l'empêcher d'interagir de façon
appropriée avec Delta.
20 La comparaison de la séquence d'acides aminés des
répétitions 11 et 12 de EGF de Notch de Drosophila et
Xenopus révèle un degré élevé d'identité d'acides
aminés, comprenant la séquence consensus de liaison du
calcium (figure 4, SEQ ID N° : 1 et N° : 2). Toutefois,
25 le niveau d'homologie n'est pas strictement différent
de celui partagé entre la plupart des autres
répétitions EGF qui présentent globalement une identité
d'environ 50 % au niveau des acides aminés. Cette
correspondance un pour un entre les répétitions EGF
30 individuelles de Notch de Drosophila et de Xenopus,
conjointement avec la conservation fonctionnelle de ELR
121
11 et 12, suggère que les 36 répétitions EGF de Notch
comprennent une zone tandem d'unités fonctionnelles
conservées.
5 7.3. DISCUSSION
Une analyse de deletion complète du domaine
extracellulaire de Notch a été utilisée pour montrer
que les régions de Notch contenant des répétitions 11
et 12 homologues de EGF sont à la fois nécessaires et
10 suffisantes pour l'agrégation induite par Notch-Delta
et que cette capacité de liaison de Delta a été
conservée dans les deux mêmes répétitions EGF de Notch
de Xenopus. L'observation du fait que l'agrégation est
cartographiée jusqu'aux répétitions 11 et 12 de EGF de
15 Notch démontre que les répétitions EGF de Notch
fonctionnent également comme domaines de liaison de
protéine spécifiques. Les répétitions 11 et 12 seules
de EGF (#32AECN + EGF (11-12)) étaient suffisantes pour
conserver la dépendance au Ca++ des interactions Notch-
20 Delta.
Les diverses constructions de deletion suggèrent
que ELR 11 et ELR 12 fonctionnent comme unité modulaire,
indépendante du contexte immédiat dans lequel elles
sont placées. Par conséquent, ni les 34 répétitions EGF
25 restantes, ni les trois répétitions Notch/lin-12
n'apparaissent nécessaires pour établir un cadre
structural requis pour que les répétitions EGF 11 et 12
fonctionnent. De façon intéressante, on a pratiquement
observé l'effet inverse : bien que l'essai d'agrégation
30 ne mesure pas la force de l'interaction, comme le site
de liaison était réduit en fragments de plus en plus
122
petits, on a observé une augmentation de la capacité
des cellules transfectées à s'agréger avec les cellules
exprimant Delta, suggérant que les séquences EGF
flanquantes normales gênent l'association entre les
5 protéines. Les 34 répétions EGF restantes peuvent
également former des domaines de liaison modulaire pour
d'autres protéines interagissant avec Notch à divers
moments pendant le développement.
L'observation selon laquelle les répétitions EGF
10 11 et 12 de Notch forment une unité discrète de liaison
de Delta constitue la première preuve concrète étayant
l'idée que chaque répétition EGF ou petit sous-groupe
de répétitions peut jouer un rôle unique pendant le
développement, éventuellement par des interactions
15 directes avec d'autres protéines. Les homologies
observées entre le domaine adhésif de Delta et Serrate
(figure 5) suggèrent que la partie homologue de Serrate
est "adhesive" en ce qu'elle induit une liaison à
d'autres protéines toporythmiques (voir paragraphe 8,
20 ci-dessous) . De plus, le gène scabrous qui code pour
une protéine sécrétée présentant une similitude au
fibrinogène, peut interagir avec Notch.
En plus de la répétition EGF, de multiples copies
d'autres motifs structuraux se produisent couramment
25 dans diverses protéines. Un exemple pertinent est
constitué par le motif cdclO/ankyrine, dont on trouve
six copies dans le domaine intracellulaire de Notch.
L'ankyrine contient 22 de ces répétitions. Des séries
peut-être répétées de motifs structuraux peuvent
3 0 représenter en général un ensemble linéaire d'une série
d'unités de liaison modulaire de protéine. Compte tenu
123
de ces résultats, conjointement à la complexité
structurale, génétique et développementale de Notch,
Notch peut interagir avec un certain nombre de ligands
différents dans un schéma temporel et spatial régulé
5 précisément tout au long du développement. Ces
interactions spécifiques d'un contexte avec des
protéines extracellulaires ont pu être induites par des
répétitions EGF et Notch/lin-12, alors que des
interactions avec des protéines cytosquelettiques et
10 cytoplasmiques ont pu être induites par les motifs
intracellulaires cdclO/ankyrine.
8. SEQUENCES QUI INDUISENT LES INTERACTIONS NOTCH-
SERRATE
15 Comme on l'a décrit ici, les deux répétitions EGF
de Notch qui induisent des interactions avec Delta, à
savoir les répétitions 11 et 12 de EGF, constituent
également un domaine de liaison de Serrate (voir Rebay
et coll., 1991, Cell 67 : 687-699).
20 Pour tester si Notch et Serrate interagissent
directement, les cellules S2 ont été transfectées avec
une construction d'expression de Serrate et mélangées
avec des cellules exprimant Notch dans un essai
d'agrégation. Pour la construction d'expression de
25 Serrate, une amorce synthétique contenant un site BamHI
artificiel immédiatement en 5' par rapport à
l'initiateur AUG en position 442 (tous les numéros des
séquences sont attribués selon Fleming et coll., 1990,
Genes & Dev. 4 : 2188-2201) et homologues jusqu'à la
30 position 464, a été utilisée en association avec une
deuxième amorce des positions 681-6 98 pour générer un
124
fragment d'ADN de ~ 260 paires de bases. Ce fragment a
été clivé avec BamHI et Kpnl (position 571) et lié dans
Bluescript KS+ (Stratagene). Cette construction
BTSer5'PCR a été vérifiée par séquençage puis clivée
5 avec Kpnl. Le fragment Kpnl de Serrate (571-2981) a été
inséré et l'orientation appropriée a été choisie, pour
générer BTSer5'PCR-Kpn. Le fragment SacII en 5 ' de
BTSer5'PCR-Kpn (sites SacII dans un poly-segment de
liaison Bluescript et dans Serrate (1199)) a été isolé
10 et utilisé pour remplacer le fragment SacII 5' de
l'ADNc (Fleming et coll., 1990, Genes & Dev. 4 : 2188-
2201), générant ainsi l'ADNc Serrate moins les régions
5 ' non traduites. Cet insert a été isolé par une
digestion par Sali et digestion partielle par BamHI et
15 inséré entre les sites BamHI et Sali de pRmHa-3 pour
générer la construction d'expression finale, Ser-mtn.
Les cellules exprimant Serrate ont adhéré aux
cellules exprimant Notch de manière calcium-dépendante
(figure 2 et Rebay et coll., 1991, ci-dessus).
20 Toutefois, contrairement à Delta, dans les conditions
expérimentales testées, Serrate n'est pas apparu
interagir de façon homotypique. De plus, aucune
interaction n'a été détectée entre Serrate et Delta.
Un sous-groupe de constructions de deletion Notch
25 a été testé et a montré que les répétitions 11 et 12 de
EGF, en plus de se lier à Delta, induisent également
des interactions avec Serrate (figure 2 ; constructions
#1, 7-10, 13, 16, 17, 19, 28 et 32) . De plus, la
fonction de liaison à Serrate de ces répétitions semble
3 0 avoir été conservée dans les deux répétitions EGF
correspondantes de Notch de Xenopus (#33ACla + XEGF
125
(10-13)). Ces résultats montrent sans ambiguïté que
Notch interagit à la fois avec Delta et Serrate et que
les deux mêmes répétitions EGF de Notch induisent les
deux interactions. La région de Serrate qui est
5 essentielle pour l'agrégation Notch/Serrate a également
été définie. La suppression des nucleotides 676-1287
(c'est-à-dire les acides aminés 79-282) (voir figure 5 ;
SEQ ID N° : 3 et N° : 4) élimine la capacité de la
protéine Serrate à s'agréger avec Notch.
10 Notch et Serrate paraissent s'agréger de façon
moins efficace que Notch et Delta, peut-être du fait
que l'interaction Notch-Serrate est plus faible. Une
explication évidente pour cette quantité réduite
d'agrégation pourrait être que la construction Serrate
15 n'a simplement pas exprimé autant de protéine au niveau
de la surface cellulaire que la construction Delta,
diminuant ainsi la force de l'interaction. En variante,
la différence de force d'interaction peut indiquer une
différence fonctionnelle fondamentale entre les
20 interactions Notch-Delta et Notch-Serrate qui peuvent
être significatives in vivo.
9. CLONAGE, SEQUENÇAGE ET EXPRESSION DE NOTCH HUMAIN
9.1. ISOLEMENT ET SEQUENÇAGE DE NOTCH HUMAIN
25 Les clones de la séquence Notch humaine ont été
obtenus initialement en utilisant la réaction en chaîne
polymerase (PCR) pour amplifier l'ADN d'une
bibliothèque d'ADNc de cerveau f?tal humain de 17-
18 semaines dans le vecteur Lambda Zap II (Stratagene).
30 Le fragment de 4 00 pb obtenu de cette manière a
ensuite été utilisé en tant que sonde avec laquelle
126
cribler la même bibliothèque de clones de Notch humains.
Le criblage initial a donné trois clones uniques, hN3k,
hN2K et hN5k, tous s ' étant avérés se trouver, lors de
l'analyse de séquence ultérieure, à l'extrémité 3' de
5 Notch humain (figure 6). Un deuxième criblage utilisant
l'extrémité 5' de hN3k comme sonde a été entrepris pour
rechercher des clones comprenant l'extrémité 5' de
Notch humain. Un clone unique, hN4k, a été obtenu à
partir de ce criblage et les données de séquençage
10 préliminaire indiquent qu'il contient la majeure partie
de l'extrémité 5' du gène (figure 6) . Conjointement,
les clones hN4k, hN3K et hN5k comprennent environ 10 kb
du/des homologue(s) humain(s) de Notch, en commençant
précocement dans les répétitions EGF et en s'étendant
15 dans la région 3' non traduite du gène. Les trois
clones sont tous des inserts d'ADNc dans le site EcoRI
de pBluescript SK" (Stratagene) . La souche hôte de E.
coli est XLl-Blue (voir Maniatis, T., 1990, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2eme éd., Cold Spring
20 Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,
p. A12) . Un alignement des séquences Notch humaines
avec Notch de Drosophila est présenté sur la figure 7.
La séquence de diverses parties de Notch contenue
dans les clones d'ADNc a été déterminée (par
25 l'utilisation de Sequenase®, U.S. Biochemical Corp.) et
est présentée pour hN2k et hN4K sur les figures 8 (SEQ
ID N° : 5-7) et 9 (SEQ ID N° : 8, 9), respectivement. La
poursuite de 1'analyse de séquence de hN2k a révélé
qu'elle code pour une séquence Notch humaine
30 chevauchante qui contenait hN5k.
127
Les séquences de nucleotide complètes de l'ADNc de
Notch humain contenu dans hN3k et hN5k ont été
déterminées par le procédé de terminaison de chaîne
didésoxy en utilisant le kit Sequenase® (U.S.
5 Biochemical Corp.). Ces séquences de nucleotides codant
pour Notch humain, dans le cadre de lecture approprié,
ont été identifiées facilement car il n'y a pas
d'introns et la traduction dans seulement l'un des trois
cadres de lecture possibles donne une séquence qui,
10 après comparaison avec la séquence d'acides aminés
déduite de Notch de Drosophila publiée donne une
séquence présentant un degré d'homologie substantiel
avec la séquence Notch de Drosophila. Les séquences
d'ADN et de protéine déduites de l'ADNc de Notch humain
15 dans hN3k et hN5k sont présentées sur les figures 10
(SEQ ID N° : 10, 11) et 11 (SEQ ID N° : 12, 13),
respectivement. Le clone hN3k code pour une partie du
polypeptide Notch commençant à peu près au tiers de la
répétition Notch/lin-12 jusqu'à plusieurs acides aminés
20 proches de l'acide aminé carboxy-terminal. Le clone hN5k
code pour une partie du polypeptide Notch en commençant
à peu près avant la région cdclO jusqu'à l'extrémité du
polypeptide et contient également la région 3' non
traduite.
25 La comparaison des séquences d'ADN et de protéine
présentée sur la figure 10 (SEQ ID N° : 10, 11) avec
celle de la figure 11 (SEQ ID N° : 12, 13) fait
apparaître des différences significatives entre les
séquences, suggérant que hN3k et hN5k représentent une
30 partie de deux gènes distincts homologues de Notch. Les
données suggèrent donc que le génome humain abrite
128
plusieurs gènes homologues de Notch. Ceci est contraire
à ce que l'on observe chez Drosophila, Notch
apparaissant être un gène de copie simple.
La comparaison des séquences d'ADN et d'acides
5 aminés des homologues Notch humains contenus dans hN3k
et hN5k avec les séquences Notch de Drosophila
correspondantes (publiées par Warton et coll., 1985,
Cell 43 : 567-581) et avec les séquences Notch de
Xenopus correspondantes (publiées par Coffman et coll.,
10 1990, Science 249 : 1438-1441 ou disponibles auprès de
Genbank® (numéro d'accès M33874)) a également fait
apparaître des différences.
La séquence d'acides aminés présentée sur la figure
10 (hN3k) a été comparée à la séquence prévue du
15 polypeptide TAN-1 présenté sur la figure 2 de Ellisen et
coll., août 1991, Cell 66 : 649-661. Certaines
différences ont été observées entre les séquences
d'acides aminés déduites ; toutefois, la séquence du
polypeptide Notch de hN3k globale est identique à 99 % à
20 la région TAN-1 correspondante (acides aminés 1455 à
2506 de TAN-1). Quatre différences ont été observées :
dans la région entre la troisième répétition Notch/lin-
12 et le premier motif cdclO, il se trouve une arginine
(hN3k) au lieu d'un X (acide aminé 1763 de TAN-1) ; (2)
25 il y a une proline (hN3k) au lieu d'un X (acide aminé
1787 de TAN-1) ; et (3) il y a un changement conservatif
d'un résidu d'acide aspartique (hN3k) au lieu d'un
résidu d'acide glutamique (acide aminé 2495, TAN-1) ; et
(4) la région carboxy-terminale diffère
30 substantiellement entre les acides aminés 2507 et 2535
de TAN-1.
129
La séquence d'acides aminés présentée sur la figure
11 (hN5k) a été comparée à la séquence prévue du
polypeptide TAN-1 présenté sur la figure 2 de Ellisen et
coll., août 1991, Cell 66 : 649-661). Des différences
5 ont été observées entre les séquences d'acides aminés
déduites. Le polypeptide Notch déduit de hN5k est
identique à 79 % au polypeptide de TAN-1 (identique à
64 % à Notch de Drosophila) dans la région cdclO qui
comprend à la fois le motif cclO (acides aminés 1860 à
10 2217 de TAN-1) et les régions flanquantes bien
conservées (figure 12). La région cdclO couvre les
acides aminés 1860 à 2217 de la séquence TAN-1. De plus,
le polypeptide codé par hN5k est identique à 65 % au
polypeptide de TAN-1 (identique à 44 % à Notch de
15 Drosophila) au niveau de l'extrémité carboxy-terminale
de la molécule contenant une région riche en PEST
(proline, acide glutamique, serine, threonine) (acides
aminés 2482 à 2551 de TAN-1) (figure 12B). L'allongement
de 215 acides aminés se trouvant entre les régions
20 mentionnées ci-dessus n'est pas bien conservé parmi les
clones homologues de Notch représentés par hN3k, hN5k et
TAN-1. Ni le polypeptide hN5k ni Notch de Drosophila ne
présente des niveaux significatifs d'identité d'acides
aminés avec d'autres protéines dans cette région (par
25 exemple, hN5k/TAN-l = identité de 24 % ; hN5k/Notch de
Drosophila = identité de 11 % ; TAN-l/Notch de
Drosophila = identité de 17 %) . En revanche, Notch de
Xenopus (Xotch) (SEQ ID N° : 16) , Notch de rat (SEQ ID
N° : 17) et TAN-1 (SEQ ID N° : 18) continuent à partager
30 des niveaux significatifs d'identité de séquence les uns
avec les autres (par exemple, TAN-1/Notch de rat = 75 %
130
d'identité, TAN-1/Notch de Xenopus = identité de 45 %,
Notch de rat/Notch de Xenopus = identité de 50 %).
L'examen de la séquence des domaines
intracellulaires des homologues de Notch de vertébrés
5 présentée sur la figure 12B a fait apparaître une
observation inattendue : toutes ces protéines,
comprenant hN5k, contiennent un motif CcN putatif,
associé à une fonction de ciblage nucléaire, dans la
région conservée suivant la dernière des six répétitions
10 cdclO (figure 12B) . Bien que Notch de Drosophila soit
dépourvu de ce motif défini, un examen plus attentif de
sa séquence a révélé la présence d'une séquence de
localisation nucléaire bipartite possible (Robbins et
coll., 1991, Cell 64 : 615-623) ainsi que des sites de
15 phosphorylation CK II et cdc2 possibles, tous à
proximité relative les uns des autres, définissant
éventuellement un autre type de motif CcN (figure 12B).
Pour isoler les clones couvrant 1'extrémité 5 ' de
hN (l'homologue de Notch humain contenu en partie dans
20 hN5k) , le clone hN2k a été utilisé comme sonde pour
cribler 260 000 plaques de bibliothèque de phage de
cerveau f?tal humain, disponible dans le commerce auprès
de Stratagene, pour l'hybridation croisée des clones.
Quatre clones ont été identifiés et isolés en utilisant
25 des processus standard (Maniatis et coll., 1982,
Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Quatre
clones ont également été isolés par hybridation à la
séquence homologue de Notch de Adams et coll., 1992,
30 Nature 355 : 632-655 qui a été obtenue auprès de l'ATCC.
131
Pour isoler des clones couvrant 1'extrémité 5 ' de
TAN-1, la bibliothèque de cerveau f?tal humain qui est
disponible dans le commerce auprès de Stratagene a été
criblée pour déterminer les clones qui prolongeraient la
5 séquence jusqu'à l'extrémité 5'. 880 000 plaques ont été
criblées et quatre clones ont été identifiés, qui se
sont hybrides de façon croisée avec la séquence hN3k. Le
séquençage a confirmé la position relative de ces
séquences dans la protéine Notch codée par TAN-1.
10 La séquence 5' de notre homologue de TAN-1 isolé a
été déterminée par le numéro de nucleotide 972 (le
numéro 1 de nucleotides étant le A dans le codon
d'initiation ATG) et comparée à la séquence publiée par
Ellisen et coll. (1991, Cell 66 : 649-661). Au
15 nucleotide 559, notre homologue de TAN-1 a un G alors
qu'Ellisen et coll. mentionnent un A, ce changement
donnant un acide aminé codé différemment. Par conséquent,
dans les 324 premiers acides aminés, notre protéine
codée par TAN-1 diffère de celle proposée par Ellisen et
20 coll. car notre protéine présente un Gly en position 187
alors qu'Ellisen et coll. décrivent un Arg dans cette
position (comme le montre la figure 13).
Les séquences d'acides aminés de longueur totale
des protéines hN (SEQ ID N° : 19) et codées par TAN-1
25 (SEQ ID N° : 20) ainsi que les protéines Notch de
Xenopus et de Drosophila sont présentées sur la figure
13. La séquence codant pour l'ADN de longueur totale
(exceptée celle codant pour l'initiateur Met) (contenu
dans SEQ ID N° : 21) et la séquence d'acides aminés
30 codée (excepté le fait que l'initiateur Met n'est pas
132
présenté) (contenu dans SEQ ID N° : 19) de hN sont
présentées sur la figure 17.
9.2. EXPRESSION DE NOTCH HUMAIN
5 Des constructions d'expression ont été produites
en utilisant des clones d'ADNc de Notch humain
présentés au paragraphe 9.1. ci-dessus. Dans le cas de
hN3k et hN2k, le clone entier a été excisé de son
vecteur en tant que fragment de restriction de EcoRI et
10 sous-cloné dans le site de restriction EcoRI de chacun
des trois vecteurs pGEX (vecteurs d'expression de
glutathion S-transférase ; Smith et Johnson, 1988, Gene
7, 31-40). Ceci permet l'expression du produit de
protéine Notch du sous-clone dans le cadre de lecture
15 correct. Dans le cas de hN5k, le clone contient deux
sites de restriction EcoRI internes, produisant des
fragments de 2,6, 1,5 et 0,6 kb. Les fragments de 2,6
et 1,5 kb ont également été sous-clonés dans chacun des
vecteurs pGEX.
20 Le système de vecteur pGEX a été utilisé pour
obtenir l'expression des protéines de fusion
(chimériques) de Notch humaines à partir des
constructions décrites ci-dessous. L'ADN de Notch clone
dans chaque cas a été inséré, en phase, dans le vecteur
25 pGEX approprié. Chaque construction a ensuite été
électroporéé dans des bactéries (E. coli) et a été
exprimée comme protéine de fusion contenant les
séquences de protéine Notch fusionnées à la terminaison
carboxyle de la protéine glutathion S-transferase.
30 L'expression des protéines de fusion a été confirmée
par analyse des extraits de protéine bactérienne par
133
électrophorèse sur gel de Polyacrylamide, en comparant
les extraits de protéine obtenus des bactéries
contenant les plasmides pGEX avec et sans l'ADN de
Notch inséré. Les protéines de fusion étaient solubles
5 dans une solution aqueuse et ont été purifiées à partir
des lysats bactériens par Chromatographie d'affinité en
utilisant de 1'agarose revêtu de glutathion (car la
terminaison carboxyle de la glutathion S-transférase se
lie à la glutathionine). Les protéines de fusion
10 exprimées ont été liées par un anticorps à Notch de
Drosophila comme le montre le test Western blot.
Les constructions utilisées pour produire les
protéines de fusion Notch-glutathion S-transférase
humaines étaient les suivantes :
15 hNFP#2 - PCR a été utilisée pour obtenir des
fragments commençant juste avant les répétitions cdclO
au nucleotide 192 de l'insert hN5k jusqu'à juste avant
la région riche en PEST au nucleotide 1694. L'ADN a été
ensuite digéré avec BamHI et Smal et le fragment obtenu
20 a été lié dans pGEX-3. Après l'expression, la protéine
de fusion a été purifiée par liaison à 1'agarose
glutathion. Le polypeptide purifié a été quantifié sur
un gel de Polyacrylamide à gradient de 4 à 15 %. La
protéine de fusion obtenue présentait un poids
25 moléculaire de 83 kD.
hN3FP#l - L'insert d'ADN hN3k entier (nucleotide 1
à 3235) a été excisé du vecteur Bluescript (SK) par
digestion avec EcoRI. L'ADN a été lié dans pGEX-3
hN3FP#2 - Un segment 3' d'ADN de hN3k (nucleotides
3 0 1847 à 323 5) plus une partie du poly-segment de liaison
134
a été clivé du vecteur Bluescript (SK) par digestion
avec Xmal. Le fragment a été lié dans pGEX-1.
Après purification, ces protéines de fusion sont
utilisées pour produire des anticorps polyclonaux et/ou
5 monoclonaux à Notch humain.
10. EXPRESSION DE NOTCH DANS LES CELLULES NORMALES ET
MALIGNES
Divers échantillons et lignées cellulaires de
10 tissus de patients humains, représentant à la fois des
cellules normales et une large diversité de cellules
malignes sont testés pour détecter et/ou quantifier
l'expression de Notch. Des échantillons de tissus de
patients sont obtenus auprès du département de
15 pathologie de la Yale University School of Medicine.
Les tests suivants sont utilisés pour mesurer
l'expression de Notch dans des échantillons de tissus
de patients : (a) hybridation Northern ; (b) Western
blots ; (c) hybridation in situ ; et (d)
20 immunocytochimie. Les tests sont réalisés en utilisant
des techniques standard. L'hybridation Northern et
l'hybridation in situ sont réalisées (i) en utilisant
une sonde ADN spécifique de la séquence Notch du clone
hN3k ; et (ii) en utilisant une sonde ADN spécifique de
25 la séquence Notch de clone hN5k. Des Western blots et
une immunocytochimie sont réalisés en utilisant un
anticorps anti-protéine Notch de Drosophila (qui
reconnaît également les protéines Notch humaines).
Les hybridations Northern et les Western blots
30 tels que décrits ci-dessus sont également utilisés pour
analyser de nombreuses lignées cellulaires,
135
représentant divers tissus normaux ou cancéreux. Les
lignées cellulaires testées sont énumérées dans le
tableau 2.
10
15
20
25
30
TABLEAU 2
Lignées de cellules humaines
Tissu/tumeur
Moelle osseuse
Cerveau
Sein
Côlon
Embryon
Reins
Leucémie
Foie
Poumon
Lignée cellulaire
IM-9
KG-1
A-172
HS 683
U-87MG
TE 671
BT-20
Hs 578BS
MDA-MB-33 0
Caco-2
SW 4 8
T84
WiDr
FHs 173We
A-498
A-704
Caki-2
ARH-77
KG-1
Hep G2
WRL 68
Calu-1
HLF-a
SK-Lu-1
136
15
25
Lymphob1astes
Lymphome
Mélanome
Neuroblastome
Ovaire
CCRF-CEM
HuT 7 8
Hs 445
MS116
U-937
A-375
G-361
Hs 294T
SK-ME1-1
10 Myelome IM-9
RPMI 8226
IMR-32
SK-N-SH
SK-N-MC
Caov-3
Caov-4
PA-1
ARH-77
A-204
20 A673
HOS
Amdur II
BUD-8
Tera-1
Tera-2
Hs67
AN3 Ca
HEC-l-A
Les malignités des types de tissu de cellules
3 0 malignes qui sont donc présentées comme exprimant
Cellules plasmatiques
Sarcome
Peau
Testicules
Thymus
Utérus
137
spécifiquement Notch peuvent être traitées comme on le
décrit au paragraphe 5.1 et seq.
10.1 L'EXPRESSION DE LA PROTEINE NOTCH HUMAINE EST
5 ACCRUE DANS DIVERSES AFFECTIONS MALIGNES
Comme on l'a décrit ci-dessous, nous avons trouvé
que l'expression de la protéine Notch humaine est
accrue dans au moins trois cancers humains à savoir, le
cancer du col de l'utérus, du sein et du côlon. La
10 coloration immunocytochimique des échantillons de
tissus des cancers du col de l'utérus, du sein et du
côlon de patients humains a montré clairement que le
tissu malin exprime des niveaux élevés de Notch, à des
taux accrus par rapport aux paragraphes de tissus non
15 malins. Ce large spectre de différentes néoplasies dans
lesquelles on observe une expression de Notch élevée
suggère que beaucoup plus d'affections cancéreuses
seront observées comme régulant positivement Notch.
Des lames d'échantillons tumoraux humains (pour
20 les tumeurs du sein, du côlon et du col de l'utérus)
ont été obtenues auprès de la banque de tissu du
département de pathologie, Yale Medical School. Les
colorations ont été réalisées en utilisant des
anticorps monoclonaux dirigés contre les protéines de
25 fusion PI et P4 qui ont été , générées à partir des
séquences de hN et TAN-1, respectivement.
Les protéines de fusion PI et P4 ont été obtenues
par 1'insertion de la séquence Notch humaine souhaitée
dans le vecteur d'expression pGEX approprié (Smith et
30 Johnson, 1988, Gene 7 : 31-40 ; AMRAD Corp., Melbourne,
Australie) et ont été purifiées par affinité selon les
138
instructions du fabricant (AMRAD Corp.). Pour la
production' de la protéine de fusion PI, pGEX a été
clivé avec BamHI et lié à un concatémère qui consiste
en trois copies d'un fragment BamHI-BglII de 518 pb.
5 Des rats ont été immunisés avec la protéine exprimée et
des anticorps monoclonaux ont été produits par des
procédés standard. Pour la production de la protéine de
fusion P4, pGEX-2 a été clivé avec BamHI et lié à un
concatémère qui consiste en trois copies d'un fragment
10 BamHI-BglII de 473 pb de TAN-1. Des rats ont été
immunisés avec la protéine d'expression et des
anticorps ont été produits par des procédés standard.
Dans toutes les tumeurs examinées, les protéines
Notch codées à la fois par les homologues de Notch
15 humains TAN-1 et hN étaient présentes à des taux accrus
dans la partie maligne du tissu comparé à la partie
normale. Des colorations représentatives sont
présentées sur les images fournies (figures 14 à 16).
Le procédé de coloration était le suivant : les
20 tissus ont été fixés dans du paraformaldehyde, englobés
dans de la paraffine, coupés en sections de 5 um
d'épaisseur et placés sur des lames de verre. Ensuite,
les étapes suivantes ont été réalisées.
1. Déparaffinisation par 4 changements de xylene,
25 4 minutes respectivement.
2. Retrait du xylene par 3 changements dans de
l'éthanol absolu, 4 minutes respectivement.
3. Réhydratation progressive des tissus par
immersion des lames dans 95 %, 90 %, 80 %, 60 % et 30 %
3 0 d'éthanol, 4 minutes respectivement. A l'extrémité, les
139
lames ont été rincées dans de l'eau distillée pendant
5 minutes.
4. Arrêt de la réaction de la Peroxydase endogène
par incubation pendant 30 minutes dans du peroxyde
5 d'hydrogène à 0,3 % dans du methanol.
5. Lavage dans du PBS (phosphate de sodium 10 mM,
pH 7,5, 0,9 % NaCl) pendant 20 minutes.
6. Incubation pendant 1 heure dans une solution
bloquante. (Solution bloquante : PBS contenant 4 % de
10 sérum de lapin normal et 0,1 Triton X-100).
7. Incubation pendant la nuit à 4 °C avec un
anticorps primaire dilué dans une solution bloquante.
Concentration finale de l'anticorps primaire 20-
50 ug/ml.
15 8. Lavage pendant 20 minutes avec du PBS + 0,1 %
Triton X-100 (3 changements)
9. Incubation pendant 30 minutes avec un anticorps
anti-rat de lapin biotinylé : 50 ul d'anticorps
biotinylé (VECTEUR) dans 10 ml de solution bloquante.
20 10. Lavage pendant 20 minutes avec du PBS + 0,1 %
Triton X-100 (3 changements).
11. Incubation avec un réactif . ABC (VECTEUR)
pendant 3 0 minutes (le réactif est constitué dans du
PBS + 0,1 % Triton X-100).
25 12. Lavage pendant 20 minutes dans du PBS + 0,1 %
Triton X-100. Puis incubation pendant 2 minutes dans du
PBS + 0,5 % Triton X-100.
13. Incubation pendant 2 à 5 minutes dans une
solution de substrat de peroxydase. Solution de
30 substrat de peroxydase : volumes égaux de peroxyde
d'hydrogène à 0,02 % dans de l'eau distillée et 0,1 %
140
10
15
de tétrahydrochlorure de diaminobenzidine (DAB) dans un
tampon Tris 0,1 M, pH 7,5 sont mélangés juste avant
l'incubation avec les tissus. Le Triton X-100 est
ajouté à la solution finale à une concentration de
0,5 %.
14. Lavage pendant 15 minutes à l'eau du robinet.
15. Contre-coloration pendant 10 minutes avec de
1'hématoxyline de Mayer.
16. Lavage pendant 15 minutes à l'eau du robinet.
17. Déshydratation par des changements dans 3 0 %,
60 %, 80 %, 90 %, 95 % et de l'éthanol absolu (4
minutes respectivement).
18. Immersion dans du xylene (2 changements, 4
minutes respectivement).
19. Montage, microscope optique.
11. DEPOT DES MICROORGANISMES
Les bactéries recombinantes suivantes, portant
respectivement un plasmide codant pour une partie de
20 Notch humain, ont été déposées le 2 mai 1991 au sein de
1'American Type Culture Collection, 1201 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, selon les clauses du Traité
de Budapest sur la reconnaissance internationale du
dépôt des microorganismes aux fins de la procédure en
25 matière de brevet.
Bactéries portant Plasmide N° d ATCC accès
XLl-Blue de hN4k 68610
E. coli
XLl-Blue de hN3k 68609

141
E. coli
XLl-Blue de hN5k 68611
E. coli
10
15
20
25
La présente invention ne se limite pas au cadre
des microorganismes déposés ou des modes de réalisation
spécifiques décrits ici. En effet, diverses
modifications de l'invention, en plus de celles
décrites ici, apparaîtront à l'homme du métier à partir
de la description précédente et des figures en annexe.
Ces modifications sont destinées à entrer dans le cadre
des revendications en annexe.
MICROORGANISMES
Fiche optionnelle concernant le microorganisme
cité en page 88, ligne 1-12 de la description.
A. IDENTIFICATION DU DEPOT
D'autres dépôts sont identifiés sur une fiche
annexe.
Nom de 1'institut de dépôt
American Type Culture Collection
Adresse de l'Institut de dépôt (y compris code
postal et pays)
123 01 Parklawn Drive
Rockvill, MD 20852
EU
Date de dépôt : 2 mai 1991, n° d'accès 68610
8. INDICATIONS SUPPLEMENTAIRES (laisser en blanc
si non applicable)
142
C. ETATS DESIGNES AUXQUELS SONT DESTINEES LES
INDICATION
D. INDICATIONS SUPPLEMENTAIRES (laisser en blanc
5 si non applicable)
E. Cette fiche a été reçue avec la demande
internationale lors du dépôt (à vérifier par l'office
recevant la demande)
10
(Agent autorisé)
La date de réception (du demandeur) par le Bureau
15 International était
(Agent autorisé)
Demande internationale n° : PCT /
de PCT/RO/134
American Type Culture Collection
20
25 12301 Parklawn Drive
Rockville, MD 20852
EU
N° d'accès Date de dépôt
30 68609 2 mai 1991
68611 2 mai 1991
143
Liste de séquences
(1) INFORMATIONS GENERALES
(i) DEMANDEUR : Artavanis-Taakonas, S. et coll.
5 (ii) TITRE DE L'INVENTION : Procédés
thérapeutiques et diagnostiques et compositions à base
de protéines et d'acides nucléiques Notch
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES : 21
10
(iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE :
(A) DESTINATAIRE : Pennie & Edmonds
(B) RUE : 1155 Avenue of the Americas
(C) VILLE : New York
15 (D) ETAT : New York
(E) PAYS : U.S.A.
(F) CODE POSTAL : 10036
(v) FORME INFORMATIQUE
20 (A) TYPE DE SUPPORT : disquette
(B) ORDINATEUR : PC compatible IBM
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION : PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL : Patentin Relaese # 1,0, version #
1,25 (EPO)
25
(vi) DONNEES SUR LA DEMANCE ACTUELLE
(A) REFERENCE DE LA DEMANDE : à attribuer
(B) DATE DE DEPOT : à la même date
(C) CLASSIFICATION :
144
(viii) MANDATAIRE/AGENT :
(A) NOM : Misrock, S. Leslie
(B) NUMERO D'ENREGISTREMENT : 18 872
5 (C) REFERENCE/NUMERO DE DOSSIER : 7326-018
(ix) TELECOMMUNICATIONS :
(A) TELEPHONE : 212 790-9090
(B) FAX : 212 8698864/9741
10 (C) TELEX : 66141 PENNIE
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 1 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
15 (A) LONGUEUR : 2892 paires de bases
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
20 (ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE :
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT : 142...264 0
25
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 1 :
CAATTCGGAG CAATTATTCA AAACATAAAC ACAATAAACA ATTTGACTAC TTCCCGCACA 60
CACACACACA CACAGCCCOT CGATTATTAC ACTAAAACCG ACACTCAATC CAAAAAATCA 120
CCAACAAAAA CATCAATAAA C ATC CAT TCC ATT AAA TCT TTA TTA ACA CCA 171
145
Met His Trp Ile Lys Cys Leu Leu Thr Ala
1 S 10
TTC ATT TCC TTC ACA CTC ATC CTC CAC GTT CAC ACT TCC CCC ACC TTT
Phe lie Cye Phe Thr Val rie Val ein Val His Ser Ser Cly Ser Phe
15 20 2S
CAO TTC CCC CTC AAC TAC TTC ACC AAC CAT CAC CCC CCC CAC AAC CAC
Clu Leu Arg Leu Lys Tyr Phe Ser Asn Asp His Cly Arg Asp Asn Clu
30 35 40
219
267
CCT CCC TCC TCC ACC GCG CAC TCC CAC CGA CCG ACC CCC AAG TCC CTG
Cly Arg Cys Cys Ser Cly Clu Ser Asp Cly Ala Thr Cly Lys Cys Leu
45 50 55
315
CCC ACC TCC AAC ACG CCC TTT CCC CTC TCC CTA AAC CAC TAC CAC CCC
Cly Ser Cys Lys Thr Arg Phe Arg Val Cys Leu Lys His Tyr Gin Ala
60 65 70
363
ACC ATC GAC ACC ACC TCC CAC TGC ACC TAC CCG GAC GTC ATC ACG CCC
Thr lie Asp Thr Thr Ser Gin Cys Thr Tyr Cly Asp Val Ile Thr Pro
75 60 65 90
411
ATT CTC CGC CAC AAC TCC CTC AAT CTC ACC CAC CCC CAO CGC TTC CAG
Ile Leu Cly Clu Asn Ser Val Asn Leu Thr Asp Ala Cln Arg Phe Cln
95 100 105
AAC AAC GCC TTC ACC AAT CCC ATC CAO TTC CCC TTC TCG TTC TCA TCG
Asn Lys Gly Phe thr Asn Pro lie Gin Phe Pro Phe Ser Phe Ser Trp
110 115 120
459
507
CCC CCT ACC TTC TCC CTC ATC CTC CAC CCC TCC CAT GAT ACC AAC AAT
Pro cly Thr Phe ser Leu île Val Glu Ala Trp His Asp Thr Asn Asn
125 130 135
S55
ACC CCC AAT CCG CCA ACC AAC AAC CTC CTC ATC CAC CGA CTC TTC CTC
Ser Cly Asn Ala Arg Thr Asn Lys Leu Leu He Cln Arg Leu Leu Val
140 145 150
603
CAG CAC CTA CTC CAC GTG TCC TCC CAA TCC AAG ACC AAC AAC TCC CAA
Cln Gin Val Leu Glu Val Ser Ser Clu Trp Lys Thr Asn Lys Ser Clu
1SS 160 165 170
651
TCC CAC TAC ACC TCG CTC CAC TAC CAT TTC CCT CTC ACC TCC CAT CTC
Sor Cln Tyr Thr Ser Leu Glu Tyr Asp Phe Arg Val Thr Cys Aap Leu
175 180 185
699
AAC TAC TAC CCA TCC OCC TGT GCC AAC TTC TGC CGC CCC CCC GAC CAT
Asn Tyr Tyr Cly Sar Cly Cys Ala Lye Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp
190 195 200
747
TCA TTT GCA CAC TCC ACT TCC TCC GAG ACC CCC GAA ATT ATC TCT TTC
Ser Phe Cly His Ser Thr Cys ser Clu Thr Cly Clu lie He Cys Leu
20S 210 21S
795
ACC CCA TCC CAC CGC CAT TAC TGT CAC ATA CCC AAA TCC CCC AAA CGC
Thr Cly Trp cln Cly Asp Tyr Cys His He Pro Lys cys Ala Lya cly
220 225 230
643
TCT CAA CAT CCA CAT TCC CAC AAA CCC AAT CAA TCC GTT TCC CAA CTC
Cys Clu His Cly Hla Cys Asp Lys Pro Asn Gin Cys Val Cys Cln Leu
235 240 245 250
CCC TCC AAC CCA CCC TTC TCC AAC CAC TCC GTT CTG GAA CCC AAC TCC
Cly Trp Lys Cly Ala Leu Cys Asn Clu Cys Val Leu Clu Pro Asn Cys
255 260 265
691
939
146
ATC CAT CCC ACC TCC AAC AAA CCC TCC ACT TCC ATC TCC AAC CAC GGT 987
He His Cly Thr Cys Asn Lye Pro Trp Thr Cys He Cys Asn Clu Gly
270 275 280
TCC CCA CCC TTC TAC TGC AAC CAC GAT CTC AAC TAC TCC ACC AAC CAC 1035
Trp Cly Cly Leu Tyr Cys Asn Cln Asp Leu Asn Tyr Cys Thr Asn His
285 290 295
ACA CCC TCC AAC AAT CCC CCA ACC TCC TTC AAC ACC CGC CAG CCA TTC 1083
Arg Pro Cys Lys Asn Cly Gly Thr Cys Phe Asn Thr Cly Clu Cly Leu
300 30S 310
TAC ACA TCC AAA TCC CCT CCA CGA TAC AGT CCT CAT GAT TCC CAA AAT 1131
Tyr Thr Cys Lys Cys Ala Pro Cly Tyr Ser Cly Asp Asp Cys Clu Asn
315 320 325 330
CAG ATC TAC TCC TGC CAT CCC CAT CTC AAT CCC TCC CAC AAT CCT CCT 1179
Clu He Tyr Ser Cys Asp Ala Asp Val Asn Pro Cys Gin Aan Gly Gly
335 340 345
ACC TCC ATC CAT CAC CCC CAC ACA AAA ACC CGC TAC AAC TGT CAT TCC 1227
Thr Cys He Asp Clu Pro Hls Thr Lys Thr Cly Tyr Lys Cys Kis Cys
350 355 360
CCC AAC CGC TCC ACC CCA AAC ATC TCC CAG CAC AAA CTG CTC ACC TCT 1275
Ala Asn Cly Trp Ser Cly Lys Met Cys Clu Glu Lys Val Leu Thr Cys
36S 370 375
TCC CAC AAA CCC TCT CAT CAC CCA ATC TCC CGC AAC CTT CCT CCT CGC 1323
Ser Asp Lys Pro Cys His Gin Cly He Cys Arg Asn Val Arg Pro Oly
380 385 390
TTC CCA ACC AAC CCT CAC CCC TAC CAC TCC CAA TCT CCC ATT CGC TAC 1371
Leu Gly Ser Lys Cly Gin Gly Tyr Gin Cys Clu Cys Pro He Cly Tyr
39S 400 405 410
ACC CCA CCC AAC TCC CAT CTC CAC CTC GAC AAC TCC ACT CCC AAT CCA 1419
Ser Cly Pro Asn Cys Aap Leu Cln Leu Asp Asn Cys Ser Pro Asn Pro
415 420 425
TCC ATA AAC GCT CGA ACC TCT CAC CCC AGC CGA AAG TCT ATT TCC CCA 1467
Cys He Asn Cly Gly Ser Cys Cln Pro Ser Cly Lys Cys He Cys Pro
430 435 440
CCG CGA TTT TCC GCA ACC ACA TCC CAG ACC AAC ATT CAC GAT TCT CTT IS15
Ala Gly Phe Ser Cly Thr Arg Cy6 clu Thr Aan He Aap Aap Cys Leu
445 450 4S5
CCC CAC CAC TGC GAC AAC CCA CCC ACC TCC ATA CAT ATC CTC AAC CAA IS63
Cly Hls Gin Cys Clu Asn Cly Cly Thr Cys He Asp Het Val Asn Cln
460 465 470
TAT CCC TCC CAA TCC CTT CCC CCT TTC CAT CCC ACC CAC TCT ACT ACC 1611 ?
Tyr Arg Cys Cln Cys val Pro Cly Phe Hls Oly Thr Hls Cys ser Ser
475 480 485 490
AAA CTT CAC TTC TCC CTC ATC ACA CCC TCT GCC AAT CCA CGA ACC TCC 1659
Lys Val Asp Leu Cys Leu He Arg Pro Cys Ala Asn Cly Cly Thr Cys
495 500 505
TTC AAT CTC AAC AAC CAT TAC CAC TCC ACC TCT CCT GCC CCA TTT ACT 1707
Leu Asn Leu Asn Asn Asp Tyr Gin Cys Thr Cys Arg Ala Cly Phe Thr
S10 515 520
CCC AAC CAT TCC TCT CTG CAC ATC CAT CAG TCC ACC ACT CCA CCC TCT 1755
Cly Lys Asp Cys Ser Val Asp He Asp Clu Cys Ser Ser Gly Pro Cys
525 530 535
147
CAT AAC CCC CCC ACT TCC ATC AAC CGC CTC AAT TCC TTC CAA TCC CTC 1803
His Asn Cly Cly Thr Cys Met Asn Arg Val Asn Ser Phe Clu cys val
540 54S SSO
TCT CCC AAT OCT TTC ACC CGC AAG CAG TCC GAT CAC CAG TCC TAC CAT 18S1
Cys Ala Asn Cly Phe Arg Cly Lys Cln Cys Asp Glu Glu Ser Tyr Asp
555 560 565 570
TCC CTG ACC TTC GAT CCC CAC CAA TAT CCA CCC ACC ACA CAA GCC ACA 1899
Ser Val Thr Phe Asp Ala His Cln Tyr Cly Ala Thr Thr Cln Ala Arg
57S 580 S85
CCC CAT CCT TTG ACC AAT CCC CAC CTA GTC CTA ATT CCT CTT TTC TCC 1947
Ala Asp Cly Leu Thr Asn Ala Cln Val Val Leu He Ala Val Phe Ser
590 595 600
CTT CCG ATC CCT TTG CTG GCG GTT ATT GCC CCG TCC CTC CTC TTC TCC 1995
Val Ala Het Pro Leu Val Ala Val He Ala Ala Cys Val Val Phe Cys
605 610 615
ATG AAG CCC AAC CCT AAC CCT CCT CAG CAA AAC CAC CAC CCG CAG GCC 2043
Met Lys Arg Lys Arg Lys Arg Ala cln Clu Lys Asp Asp Ala clu Ala
620 625 630
ACG AAG CAC AAC GAA CAC AAT CCC GTC CCC ACA ATC CAT CAC AAT CCC 2091
Arg Lys Gin Asn Clu Cln Asn Ala Val Ala Thr Met His His Asn Cly
635 640 645 650
ACT CCC CTC CCT CTA CCT TTC CCT TCA GCC TCT CTC.CGC CCC AAA ACT 2139
Ser Cly Val Gly Val Ala Leu Ala Ser Ala Ser Leu Cly Gly Lys Thr
655 660 665
CGC ACC AAC ACC GGT CTC ACC TTC GAT CCC CGC AAC CCC AAT ATC ATC 2167
Gly Ser Asn Ser cly Leu Thr Phe Asp Cly Cly Asn Pro Asn He He
670 675 680
AAA AAC ACC TCC CAC AAC TCC CTC AAC AAC ATT TCT CCC TCA CCA CCA 223S
Lys Asn Thr Trp Asp Lye Ser Val Asn Asn He Cys Ala Ser Ala Ala
68S 690 695
CCA CCG CCC CCC CCC CCA GCA GCC CCG GAC CAC TCT CTC ATG TAC CCC 2283
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp clu Cys Leu Met Tyr Gly
700 70S 710
GCA TAT CTC CCC TCC CTC CCC CAT AAC AAC AAT CCC AAC TCA CAC TTT 2331
Cly Tyr Val Ala Ser Vat Ala Asp Asn Asn Asn Ala Asn Ser Asp Phe
715 720 725 730
TCT CTC CCT CCC CTA CAA ACA CCC AAC TCC CAA AAC CAA CTC AAC ACC 2379
Cys Val Ala Pro Leu Gin Arg Ala Lys Ser Cln Lys cln Leu Asn Thr
735 740 745
GAT CCC ACC CTC ATC CAC CCC CCT TCC CCC CCA CCC ACC TCA CCC AAC 2427
Asp Pro Thr Leu Met His Arg Cly Ser Pro Ala Cly Ser Ser Ala Lys
750 755 760
CCA CCC TCT CCC CCA CGA CCG CCA CCG CCG CAO CCC AAC ACC ATC TCT 2475
Cly Ala ser Cly Cly Cly Pro Cly Ala Ala Clu Cly Lys Arg He SQt
765 770 775
CTT TTA CCC CAC CCT TCC TAC TCT ACC CAC COT TCG CCC TCC TTC CCG 2S23
Val Leu Gly Clu Cly Ser Tyr Cys ser ein Arg Trp Pro ser Leu Ala
780 785 790
CCC CCC CGA CTC CCC GGA CCC TCT TCA TCC CAG CTA ATG CCT GCA GCT 2571
Ala Ala Cly Val Ala Cly Ala Cys ser ser Cln Leu Met Ala Ala Ala
795 800 80S .810
148
TCC CCA CCC CGC ACC CGA CCG CCC ACC CCG CAA CAC CAC CCA TCC CTC 2619
Set Ala Ala Cly Ser Cly Ala Cly Thr Ala Cln Cln Cln Arg ser Val
815 820 825
CTC TCC CCC ACT CCG CAT ATC TAACTCCAAA AATCCCGAAC CCCTCCTCCT 2670
Val Cys Cly Thr Pro Hls Met
830
AAATCCCGAC AAATCCCCAT CCACCACCTC ACACCACATA CACAAAGAAA ACACTCCCTT 2730
GGCTTCAAAA TCTCACACAC ACCCCAAAAT CTTCTTCTTC ATTCAACCAC TTTACTCCTC 2790
ACGAAAAATC AAAAATCTCT AACAGCCATA ACTCGTAAAC TCCCTAAAAA ATTTGTATAC 2850
TAATTACCAA ACCTCTCACC CACCCCTTTC CATCCCCAAT TC 2892
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 2 :
5 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 833 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
(D) TOPOLOGIE : inconnue
10 (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 2
149
Met His Trp He Lys Cys Leu Leu Thr Ala Phe He Cys Phe Thr Val
1 S 10 15
Ile Val Cln Val His Ser Ser Gly Ser Phe Clu Leu Arg Leu Lys Tyr
20 25 30
Phe Ser Asn Asp His Gly Arg Asp Asn Glu Gly Arg Cys Cys Ser Gly
35 40 45
Glu Ser Asp Gly Ala Thr Gly Lys Cys Leu Gly Ser Cys Lys Thr Arg
SO 55 60
Phe Arg Val Cys Leu Lye His Tyr Gin Ala Thr He Asp Thr Thr Ser
65 70 75 80
Gin Cys Thr Tyr Gly Asp Val He Thr Pro He Leu Gly Glu Asn Ser
85 90 9S
Val Asn Leu Thr Aap Ala Gin Arg Phe Gin Asn Lys Cly Phe Thr Asn
.100 105 110
Pro He Gin Phe Pro Phe Ser Phe Ser Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu
115 120 125
He Val Glu Ala Trp Hie Asp Thr Asn Asn Ser Gly Asn Ala Arg Thr
130 13S 140
Aen Lys Leu Leu He Gin Arg Leu Leu Val Gin Gin Val Leu Glu Val
145 150 ISS 160
Ser Ser Clu Trp Lys Thr Asn Lys Ser Glu Ser Gin Tyr Thr Ser Leu
165 170 175
Clu Tyr Asp Phe Arg Val Thr eye Aap Leu Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly
160 r ISS 190
cya Ala Lys Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp Ser Phe Cly His ser Thr
1 195 200 20S
150
Cys Ser Clu Thr Cly clu He He Cys Leu Thr Cly Trp Cln Cly Asp
210 215 220
Tyr Cys His Ile Pro Lys Cys Ala Lys Cly Cys Clu His Cly His Cys
225 230 235 240
Asp Lys Pro Asn Cln Cys Val Cys Cln Leu Cly Trp Lys Cly Ala Leu
245 250 2SS
Cys Asn Glu Cys Val Leu Glu Pro Asn Cys Ile His Cly Thr Cys Asn
260 265 270
Lys Pro Trp Thr Cys Ile Cys Asn Clu cly Trp Gly cly Leu Tyr Cys
275 280 285
Asn Gin Asp Leu Asn Tyr Cys Thr Asn Hie Arg Pro Cys Lys Asn Cly
290 29S 300
Gly Thr Cys Phe Asn Thr Cly Glu Gly Leu Tyr Thr Cys Lys Cys Ala
305 310 315 320
Pro Gly Tyr Ser Gly Asp Asp Cys Glu Asn Glu Ile Tyr Ser Cys Asp
325 330 335
Ala Asp Val Asn Pro Cys Cln Asn Gly Cly Thr Cys He Asp Clu Pro
340 345 350
His Thr Lys Thr Cly Tyr Lys Cys Kis Cys Ala Asn Gly Trp Ser Gly
3SS 360 365
Lys Met Cys Glu Glu Lys Val Leu Thr Cys Ser Asp Lys Pro Cys His
370 375 380
Gin Gly Ile Cys Arg Asn Val Arg Pro Cly Leu Cly Ser Lys Cly Gin
385 390 395 400
Gly Tyr Gin Cys Glu Cys Pro He Cly Tyr Ser Cly Pro Asn Cys Asp
40S 410 415
Leu Gin Leu Asp Asn Cys Ser Pro Asn Pro Cys Ile Asn Gly Oly ser
420 425 430
Cys Gin Pro Ser Gly Lys Cys He Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Thr
435 440 445
Arg cys Glu Thr Asn He Asp Asp Cys Leu Gly Hls Gin Cys Glu Asn
450 4S5 460
Gly Cly Thr Cys Ile Aep Met Val Asn Cln Tyr Arg Cys Gin Cys Val
465 470 475 480
Pro Gly Phe His Gly Thr His Cys Ser Ser Lys Val Asp Leu Cys Leu
48S 490 495
Ile Arg Pro Cys Ala Asn Gly Cly Thr Cys Leu Asn Leu Asn Asn Asp
500 505 510
Tyr Gin Cys Thr Cye Arg Ala Cly Phe Thr Cly Lys Asp Cys Ser Val
SIS S20 525
Aap Ile Asp Glu Cys Ser Ser Cly Pro Cys His Asn Cly Cly ?hr Cys
530 535 540
Met Asn Arg Val Asn Ser Phe Glu Cys Val Cys Ala Asn Cly Phe Arg
545 550 555 560
Gly Lys Gin Cya Asp Glu Glu Ser Tyr Asp Ser Val Thr Phe Asp Ala
151
5
565 570 575
His Gin Tyr Gly Ala Thr Thr cln Ala Arg Ala Asp Cly Leu Thr Asn
580 585 S90
Ala Gin val Val Leu He Ala Val Phe Ser Val Ala Het Pro Leu Val
595 600 605
Ala val He Ala Ala Cya Val Val Phe Cys Met Lys Arg Lys Arg Lys
610 615 620
Arg Ala Gin Clu Lys Asp Asp Ala Glu Ala Arg Lys Gin Asn Glu Gin
625 630 63S 640
Asn Ala Val Ala Thr Met His His Asn Gly Ser Cly Val Gly Val Ala
645 6S0 655
Leu Ala Ser Ala Ser Leu GLy Gly Lys Thr Gly Ser Asn Ser Gly Leu
660 665 670
Thr Phe Asp Gly Gly Asn Pro Asn He He Lys Asn Thr Trp Asp Lys
675 680 685
Ser Val Asn Asn He Cys Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
690 695 700
Ala Ala Ala Asp Glu Cys Leu Met Tyr Gly Gly Tyr Val Ala Ser Val
70S 710 715 720
Ala Asp Asn Asn Asn Ala Asn Ser Asp Phe Cys Val Ala Pro Leu Gin
725 730 735
Arg Ala Lys Ser Gin Lys Gin Leu Asn Thr Asp Pro Thr Leu Met His
740 74S 750
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Ser Ser Ala Lys Gly Ala Ser Gly Gly Gly
7SS 760 765
Pro Gly Ala Ala Glu Gly Lys Arg He Ser Val Leu Gly Glu Gly Ser
770 775 780
Tyr Cys Ser Gin Arg Trp Pro Ser Leu Ala Ala Ala Cly Val Ala Gly
785 790 795 800
Ala Cys Ser Ser Gin Leu Met Ala Ala Ala Ser Ala Ala Gly Ser Gly
805 610 615
Ala Gly Thr Ala Gin Cln Gin Arg ser Val Val Cys cly Thr Pro Hie
820 82S 830
Met
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 3 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 132 0 paires de bases
10
152
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE :
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT : 442...1320
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 3
153
CCCAGTCGAC CCCCGTGCTT CGAGCCCTCA TCACCCCCTT TTCTCTCAAC GCTAAACATC 60
TACAAAACAT CAGCGCCTAT CAAGTGGAAC TCTCAAGTGT GAACAAAACA AAAACCACAC 120
AAGCACATAC TAAGGTCCAT ATAAATAATA AATAATAATT CTGTCTCATA ACAACATTAT 180
CCAAACAAAA CCAAACAAAA CGAACCCAAA CTGCACAAAA TCATACACCA TCCACAGTAC 240
CCCCCTTATT CAGCTATCCA CACCAACTCT AGTCTCGCAA AATACAAACA AACAAAGCCA 300
CCAAAATCTC CATACATGGG CTAATTAACC CTGCCCAGCG. AATTTACATT TGTCTGCTGC 360
CAATCCAGAC TCAATCCCAA ACAAACTCCA TCTAGATCGC CAACCACCAT CACGCTCCCA 420
AACGCCCCCA CAATGTACAA A ATC TTT ACC AAA CAT TTT CCG CGA AAA CCA 471
Met Phe Arg Lys His Phe Arg Arg Lys Pro
1 5 io
CCT ACG TCG TCG TCG TTG CAG TCA ACA ATA CAA TCA CCA CAC AGC CTG S19
Ala Thr Ser Ser Sar Leu Clu Ser Thr He Clu Ser Ala Asp Ser Leu
15 20 25
CCA ATC TCC AAG AAC ACC CCC ACA AAA ACG CAC CCT CCC ACC CAT CGG S67
Cly Met Ser Lys Lys Thr Ala Thr Lys Arg Cln Arg Pro Arg His Arg
30 35 40
CTA CCC AAA ATC GCG ACC CTC CCA TCG ACC ATC CCC CAT TCT CCA TCA 615
Val Pro Lys He Ala Thr Leu Pro ser Thr He Arg Asp Cys Arg Ser
45 SO SS
TTA AAG TCT CCC TCC AAC TTA ATT CCT TTA ATT TTA ATA CTC TTA CTC 663
Leu Lys Ser Ala Cys Asn Leu He Ala Leu He Leu Ile Leu Leu Val '
60 65 70 '
CAT AAC ATA TCC CCA CCT CCT AAC TTC GAC CTC CAA ATA TTA CAA ATC 711
His Lys He ser Ala Ala Cly Asn Phe Clu Leu clu He Leu Clu He
75 80 8S 90
TCA AAT ACC AAC AGC CAT CTA CTC AAC CCC TAT TCC TCC CCC ATC CCA 759
Ser Asn Thr Asn Ser His Leu Leu Asn Oly Tyr Cys cys Cly Met Pro
95 100 105
CCG CAA CTT ACC CCC ACC AAG ACC ATA CGC TCC TCC CCA TCC ACC ACC 807
Ala Clu Leu Arg Ala Thr Lya Thr He Cly Cys Ser Pro Cys Thr Thr
110 115 120
GCA TTC CCC CTC TGC CTC AAC CAC TAC CAC ACC ACC CAC CAC CCT CCC 8SS
Ala Phe Arg Leu Cys Leu Lys Clu Tyr Cln Thr Thr Clu Cln Cly Ala
125 130 135
ACC ATA TCC ACG CCC TCT TCC TTT CCC AAC CCC ACC ACC AAG ATA CTC 903
Ser He Ser Thr Cly Cys Ser Phe Cly Asn Ala Thr Thr Lye He Leu
140 145 150
CCT CGC TCC ACC TTT GTG CTC AGC CAT CCC CCT CTC CCA CCC ATT CTC 951
Cly Cly Ser Ser Phe Val Leu Ser Asp Pro Cly Val Cly Ala He Val
155 160 165 170
CTC CCC TTT ACC TTT CCT TCG ACC AAC TCC TTT ACG CTC ATA CTC CAC 999
Leu Pro Phe Thr Phe Arg Trp Thr Lys Ser Phe Thr Leu He Leu Cln
175 180 185
CCC TTC CAT ATC TAC AAC ACA TCC TAT CCA OAT CCC CAC AGC TTA ATT 1047
154
Ala Leu Asp Met Tyr Asn Thr Ser Tyr Pro Asp Ala Clu Arg Leu He
190 195 200
CAC CAA ACA TCA TAC TCC GCC CTG ATA CTC CCC TCC CCC GAC TCC AAC 1095
Clu Clu Thr Ser Tyr Ser Gly Val He Leu Pro Ser Pro Glu Trp Lys
20S 210 21S
ACC CTC CAC CAC ATC CGC CCG AAC CCG CCC ATC ACC TAC CGT GTC CGC 1143
Thr Leu Asp His He Gly Arg Asn Ala Arg Ho Thr Tyr Arg Val Arg
220 225 230
CTC CAA TCC CCC CTT ACC TAC TAC AAC ACG ACC TCC ACG ACC TTC TCC 1191
Val Cln Cys Ala Val Thr Tyr Tyr Asn Thr Thr Cys Thr Thr Phe Cys
235 240 245 250
CCT CCC CCC GAC CAT CAC TTC CGT CAC TAC CCC TCC CGC TCC GAC CCT 1239
Arg Pro Arg Asp Asp Cln Phe Cly His Tyr Ala Cys Gly Ser Clu Cly
255 260 265
CAG AAC CTC TCC CTC AAT CGC TCG CAC CCC CTC AAC TCC CAC CAG CCC 1267
Cln Lys Leu Cys Leu Asn Gly Trp Gin Cly Val Asn Cys Clu Clu Ala
270 275 280
ATA TCC AAC GCC CCC TCC CAC CCC GTC CAC CGC 1320
He Cys Lye Ala cly Cys Asp Pro Val His Cly
285 290
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 4 :
5 (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 2 93 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
(D) TOPOLOGIE : inconnue
10 (ii) TYPE DE MOLECULE : protéine
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 4
155
Met Phe Arg Lys His Phe Arg Arg Lys Pro Ala Thr Ser Ser Ser Leu
1 S 10 15
Glu Ser Thr He Glu Ser Ala Asp Ser Leu Gly Met Ser Lys Lys Thr
20 2S 30
Ala Thr Lys Arg Gin Arg Pro Arg His Arg Val Pro Lys He Ala Thr
35 40 45
Leu Pro Ser Thr He Arg Asp Cys Arg Ser Leu Lys Ser Ala Cys Asn
SO 55 60
Leu He Ala Leu He Leu He Leu Leu Val His Lys He Ser Ala Ala
65 70 75 80
Gly Asn Phe Glu Leu Glu He Leu Glu He Ser Asn Thr Ash Ser His
85 90 95
Leu Leu Asn Gly Tyr Cys Cys Gly Met Pro Ala Glu Leu Arg Ala Thr
100 105 110
Lye Thr He Gly Cys Ser Pro Cys Thr Thr Ala Phe Arg Leu Cys Leu
115 120 12S
Lys Glu Tyr Gin Thr Thr Glu Gin Gly Ala Sex He Ser Thr Gly Cys
130 13S 140
Ser Phe Gly Asn Ala Thr Thr Lys He Leu Gly Gly Ser Ser Phe Val
145 ISO 155 160
Leu Ser Asp Pro Gly Val Gly Ala He Val Leu Pro Phe Thr Phe Arg
16S 170 17S
Trp thr Lys Ser Phe Thr Leu He Leu Gin Ala Leu Asp Met Tyr Asn
180 185 190
Thr Ser Tyr Pro Asp Ala Glu Arg Leu He Clu Glu Thr Ser Tyr Ser
195 200 205
Gly Val lie Leu Pro Ser Pro Glu Trp Lys Thr Leu Asp His He Gly
210 215 220
Arg Asn Ala Arg He Thr Tyr Arg Val Arg val Cln Cys Ala Val Thr
22S 230 23S 240
Tvr Tvr Asn Thr Thr Cys Thr Thr Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp Cln
245 250 2S5
Phe Gly His Tyr Ala Cys Gly Ser Clu cly Gin Lys Leu Cys Leu Asn
260 265 270
Gly. Trp Gin Gly Val Asn Cys Glu Glu Ala He Cys Lys Ala Gly Cys
275 280 285
Asp Pro Val His Gly
290
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 5 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
156
(A) LONGUEUR : 267 paires de bases
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 5 :
CCCTCCACTT CCTTCGTCTA TTGCTCCGAG CCCTCGCGAA CCCCCCCTAA CACTCAAACC 60
TCCAGTACCC ATTTCCOTCA TAACCCCTTC CTCCCCCCCT ACCCCTCCGA CTCACGTCGA 120
CCGGACCTCC ACAACCCCCC CCCGACCCCT CCTACATGCT CTAACCTCTT TACCCCACCC 180
CCCAAACCCC TCACACCGAA ACGGCTCAAC CCTAACTACC CCGTCCTCCT GCCCGTCCAT 240
CCACTCTCCT AACACCCTCC CCTTAAG 267
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 6 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
15 (A) LONGUEUR : 574 paires de bases
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
2 0 (ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 6 :
10
157
CAATTCCTTC CATTATACGT CACTTTTCTC AAACTCTACC CACCCTACTC TCTCTAACTC 60
CCTCTCCACT TTGTCAGCTT TCCTCTTTTC AAACACCACC CTCTCTTCAA CCTCCTTAAT 120
CCGGGCATCC TCCACTTTGG TCTCCGTCTC AAGATCACCT TTCGTAATTG ATTCTTCTTC 180
AACCCCGAAC TCAAGCCTCG CTCTCACCCT CTACGCAGAC CAGGAATTCC CAGCTCCATG 240
TCTTAGATCT CAATCTCCCT GCCCCAGATC CCTCCACCCC ATTCATCTTC CCTTCTCTCC 300
GAGCACGCAG CTCAGATTTG AGTGATGAAG ATCAAGATGC AGAGGACTCT TCTGCTAACA 360
TCATCACAGA CTTCCTCTAC CAGCGTGCCA CCCTCCAGNC CACACAGACC GGACTGCTGA 420
CATCGCCCTG CACCTTGCAG CCCGCTACTC ACCGCCTGAT CCTCCCAAGC GTCTCCTGGA 480
TCCAGCTCCA GATGCCAATG CCCAGGACAA CATCGGCCGC TGTCCACTCC ATGCTGCACT 540
CCCACGTCAT GCCAACGTGT ATTCAGATCT CTTA s74
10
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 7 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 295 paires de bases
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 7
15
TCCACATTCT CATTCGCAAC CGACTAACTG ATCTACATGC CACCATGAAT GATCGTACTA
CACCCCTCAT CCTCCCTCCC CCCCTGGCTO TGGAGGGAAT CGTGGCAGAA CTCATCAACT
CCCAACCCCA TCTCAATGCA CTCCATGACC ATCCAAAATC TCCTCTTCAC TCCCCACCTC
CTCTCAATAA TCTCGAGCCA ACTCTTTTCT TGTTCAAAAA TCGCCCCAAC CCACACATCC
ACCACAACAA CGAACAGACA CCTCTGTTTC TTCCTCCCCC CCACGACCTA TAACC
60
120
180
240
295
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 8
20
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR : 24 8 paires de bases
10
158
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 8 :
CAATTCCATT CACCACCAAA CCCTCCGCAG ACAACCACCC ACCCACTTTC CCCTCCCTCC 60
ACTCCTTCCC ACCTCCCTCC ACCCCCACCT CTCACCCCCC CACCTGCCCC CCGAGTCCCA 120
TTCAGAAAAT TCCACAAAAG CCCTACCCCA ACTCCCACCC CAACCTCACA CCCCTCGCTA 180
CCAACTCCCA CACAAACACC CACCCTCTCT CCCCCACGCC CCCATCCCAC CCCCTCCAGC 240
CAGACCTC 248
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 9 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
15 (A) LONGUEUR : 323 paires de bases
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
20 (ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 9 :
TACCTATCTC CACCACACAC ACCTCACCTA CACTTTTNNA CTCCCACCCA CATTCCTCCC 60
ACCACTACCA ACATTTACCC TCACTACCCT ACGTCCATCC CCAACACTAC CACACGTACG 120
CAGCTACAGC TCCCGCTCGC TAAACTCCCA CCACTGAAAC CTCCCCTCGA CACTCCCTAA 180
CCCAACAACA CCCCCAGATC TTACACAACC TCTCCCCCCC ACACTCGCCC TCCGGTCACG 240
CGCCCTTAAC CACCTCCCCC CCNNNACCTC ATCAACATCT CCNCNCCCOC CGCCCCACCT 300
CCAGCNCCAA AACAAGCCAA ATC 323
159
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 10
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
5 (A) LONGUEUR : 3234 paires de bases
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
10 (ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE :
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT : 1...3234
15
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 10
TCC CAC CAC CAC CCG GCC AAC AAC CTC TCC ACC CTC CAC TCC AAC AAC 48
Cys Cln Glu Asp Ala Cly Asn Lys Val cys Ser Leu Gin Cys Asn Asn
15 10 15
CAC CCC TCC CCC TGC CAC CCC GCT CAC TCC TCC CTC AAC TTC AAT CAC 96
His Ala Cya Cly Trp Asp cly Cly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp
20 25 30
CCC TCC AAC AAC TCC ACG CAG TCT CTC CAG TCC TCC AAC TAC TTC ACT 144
Pro Trp Lys Asn Cys Thr ein Ser Leu Cln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser
35 40 45
CAC GCC CAC TCT CAC ACC CAG TCC AAC TCA GCC CGC TCC CTC TTC CAC 192
Asp Cly His Cys Asp Ser cm Cys Asn Ser Aia cly Cys Leu Phe Asp
SO SS 60
CCC TTT GAC TCC CAC CCT CCG CAA CCC CAC TCC AAC CCC CTC TAC CAC 240
160
Cly Phe Asp Cys Cln Arg Ala Glu Cly Gin Cya Asn Pro Leu Tyr Asp
65 70 75 80
CAG TAC TCC AAC CAC CAC TTC AGC CAC GCG CAC TGC GAC CAC CGC TGC 288
Cln Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Cly His Cys Asp Gin Cly Cys
fiS 90 9S
AAC ACC CCG GAG TCC CAC TCG CAC CGG CTC GAC TCT GCG CAC CAT CTA 336
Aan Ser Ala Clu Cys Clu Trp Asp Cly Leu Asp Cys Ala Clu His Val
100 10S HO
CCC CAC ACC CTC CCC CCC CCC ACC CTG CTC CTG CTG GTC CTG ATG CCC 384
Pro Glu Arg Leu Ala Ala Cly Thr Leu Val Val Val Val Leu Met Pro
115 120 125
CCC CAC CAG CTG CCC AAC ACC TCC TTC CAC TTC CTC CCC CAG CTC ACC 432
Pro Clu Gin Leu Arg Asn Ser Ser Phe His Phe Leu Arg Clu Leu Ser
130 13S 140
CCC CTC CTC CAC ACC AAC CTC GTC TTC AAG CCT CAC CCA CAC CCC CAC 480
Arg val Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg Asp Ala His Oly cln
145 ISO 155 160
CAC ATG ATC TTC CCC TAC TAC CCC CGC CAG CAC CAG CTC CCC AAG CAC 528
Cln Met He Phe Pro Tyr Tyr Cly Arg Clu Clu Clu Leu Arg Lys His
165 170 175
CCC ATC AAC CCT CCC CCC CAC CGC TCC CCC GCA CCT GAC CCC CTC CTC 576
Pro He Lys Arg Ala Ala Clu Cly Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu
180 185 190
CGC CAG CTC AAG CCC TCG CTC CTC CCT GCT CCC ACC GAC CGT CGC CCC 624
Cly Cln Val Lys Ala Ser Leu Leu Pro Gly Cly Ser Glu Gly Gly Arg
195 200 20S
CCC CCC ACC CAC CTG CAC CCC ATC CAC CTC CCC CGC TCC ATC CTC TAC 672
Arg Arg Arg Clu Leu Asp Pro Met Asp Val Arg Cly Ser He Val Tyr
210 215 220
CTC CAC ATT CAC AAC CGC CAO TOT GTC CAC CCC TCC TCC CAO TCC TTC 720
Leu Clu He Asp Asn Arg Cln cys Val Cln Ala Ser Ser Cln Cys Phe
225 230 235 240
CAG ACT CCC ACC GAC GTC GCC CCA TTC CTC CCA CCC CTC CCC TCC CTC 768
Cln Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Cly Ala Leu Ala Ser Leu
245 2S0 255
CCC ACC CTC AAC ATC CCC TAC AAG ATC CAC CCC CTG CAC ACT CAC ACC 816
Gly Ser Leu Asn He Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val Gin Ser Clu Thr
260 265 270
CTO CAG CCC CCC CCC CCG CCC CAC CTC CAC TTC ATG TAC CTC GCC GCG 864
Val Clu Pro Pro Pro Pro Ala Cln Leu His Phe Met Tyr Val Ala Ala
275 280 285
CCC CCC TTT CTC CTT CTG TTC TTC CTG GGC TGC CGC CTC CTC CTC TCC 912
Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Cly Cys Cly Val Leu Leu Ser
290 295 300
CCC AAC CGC CGC CCG CAG CAT CCC CAG CTC TCG TTC CCT CAC CGC TTC 960
Arg Lys Arg Arg Arg Cln Hia Cly Gin Leu Trp Phe Pro Clu cly Pho
305 310 315 320
AAA CTC TCT CAG CCC ACC AAC AAC AAG CGC CCG GAC CCC CTC CGC CAO 1008
Lys Val Ser Clu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Clu Pro Leu Cly Clu
325 330 335
161
CAC TCC CTC CCC CTC AAG CCC CTC AAC AAC CCT TCA CAC CCT CCC CTC 10S6
Aop Ser Val Cly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Cly Ala Leu
340 345 3S0
ATC CAC CAC AAC CAC AAT CAC TCC CGC CAC CAG CAC CTC CAC ACC AAC 1104
Het Asp Asp Asn Cln Asn Clu Trp Cly Asp Clu Asp Leu Clu Thr Lys
3SS 360 365
AAC TTC CGC TTC CAG CAC CCC CTC CTT CTC CCT CAC CTG CAC GAC CAG H 52
Lys Phe Arg Phe Clu Clu Pro Val Val Leu Pro Asp Leu Asp Asp Cln
370 37S 380
ACA CAC CAC CCC CAC TCG ACT CAG CAG CAC CTC GAT GCC CCT CAC CTC 1200
Thr Asp His Arg Cln Trp Thr Gin Cln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
CCC ATC TCT GCC ATG CCC CCC ACA CCC CCC CAC CCT CAC CTT CAC CCC 1248
Arg Met See Ala Met Ala Pro Thr Pro Pro Cln Cly Clu Val Asp Ala
405 410 415
CAC TGC ATG CAC CTC AAT CTC CGC CGC CCT CAT CCC TTC ACC CCC CTC 1296
Asp Cys Met Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Cly Phe Thr Pro Leu
420 425 430
ATC ATC CCC TCC TCC ACC GCC CCC CCC CTC GAG ACC CCC AAC AGC CAC 1344
Met He Ala Ser Cys Ser Cly Gly Cly Leu Clu Thr Cly Asn Ser Clu
435 440 445
GAA CAC CAG CAC CCC CCC CCC CTC ATC TCC GAC TTC ATC TAC CAG CCC 1392
Clu Clu Clu Asp Ala Pro Ala Val He Ser Asp Phe He Tyr Gin Cly -
450 4SS 460
CCC ACC CTC CAC AAC CAC ACA CAC CCC ACC CGC CAC ACC CCC TTC CAC 1440
Ala Ser Leu His Asn Cln Thr Asp Arg Thr Cly Clu Thr Ala Leu Hin
465 470 475 480
CTC CCC GCC CCC TAC TCA CCC TCT CAT CCC CCC AAC CGC CTC CTC CAC 1488
Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Clu
485 490 495
CCC ACC CCA CAT CCC AAC ATC CAC GAC AAC ATC CCC CCC ACC CCC CTC 1536
Ala Ser Ala Asp Ala Asn He Cln Asp Asn Met Cly Arg Thr Pro Leu
S00 SOS 510
CAT CCC CCT CTC TCT CCC CAC CCA CAA CCT CTC TTC CAO ATC CTC ATC 1584
His Ala Ala Val Ser Ala Asp Ala Cln Cly Val Phe cln He Leu He
515 520 S2S
CCC AAC CCA CCC ACA CAC CTC CAT CCC CGC ATG CAT CAT CCC ACC ACC 1632
Arg Aan Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp Cly Thr Thr
530 535 540
CCA CTC ATC CTC CCT CCC CCC CTC CCC CTC GAC CCC ATC CTC CAG CAC 1680
Pro Leu He Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Clu Cly Met Leu Clu Asp
54S 550 555 S6Ô
CTC ATC AAC TCA CAC CCC CAC CTC AAC CCC CTA CAT CAC CTC CCC AAC 1728
Leu He Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu Oly Lya
S65 S70 575
TCC CCC CTC CAC TCG CCC CCC CCC CTC AAC AAT CTC CAT CCC CCA CTT . 1776
Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala val Asn Asn Val Asp Ala Ala val
580 S6S 590
GTC CTC CTC AAC AAC CCC CCT AAC AAA CAT ATC CAC AAC AAC ACG CAC 1824
Val Leu Leu Lys Asn Cly Ala Asn Lys Asp Het Cln Asn Asn Arg Clu
S95 600 605
162
GAG ACA CCC CTC TTT CTG CCC CCC CGC GAG CCC AGC TAC CAC ACC CCC 1872
Clu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Cly Ser Tyr Clu Thr Ala
610 61S 620
AAG CTC CTC CTC CAC CAC TTT GCC AAC CCC CAC ATC ACC CAT CAT ATC 1920
Lys Val Leu Leu Asp His Phe Als Asn Arg Asp He Thr Asp Hin Met
625 630 635 640
CAC CCC CTC CCC CGC CAC ATC GCA CAG CAC CCC ATC CAT CAC CAC ATC 1968
Asp Arg Leu Pro Arg Asp He Ala Cln Clu Arg Met His His Asp He
645 650 655
CTC ACC CTC CTC CAC CAC TAC AAC CTC CTC CGC ACC CCC CAC CTC CAC 2016
Val Arg Leu Leu Asp Clu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Cln Leu His
660 66S 670
CCA CCC CCC CTC CGC CCC ACC CCC ACC CTC TCC CCC CCG CTC TCC TCC 2064
Cly Ala Pro Leu Gly cly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser
675 680 68S
CCC AAC CGC TAC CTC GGC AGC CTC AAG CCC CCC CTC CAG CCC AAC AAG 2112
Pro Asn Cly Tyr Leu Cly Ser Leu Lys Pro Cly Val Cln cly Lys Lys
690 695 700
CTC CGC AAG CCC ACC ACC AAA GCC CTG CCC TCT CGA ACC AAG CAG CCC 2160
Val Arg Lys Pro Ser Ser Lys Cly Leu Ala Cys Cly Ser Lys Clu Ala
705 710 71S 720
AAC CAC CTC AAC CCA CCC ACG AAC AAC TCC CAC GAT CGC AAG CCC TCC 2208
Lya Asp Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Cln Asp Gly Lys Gly Cys
72S '730 73S
CTC CTG GAC ACC TCC CCC ATC CTC TCG CCC CTO GAC TCC CTO CAC TCA 22Só
Leu Leu Asp Ser Ser Cly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Clu Ser
740 745 750
CCC CAT CGC TAC CTC TCA CAC GTG CCC TCC CCC CCA CTG CTO CCC TCC 2304
Pro His Cly Tyr Leu See. Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu pro Ser
755 760 765
CCC TTC CAC CAC TCT CCC TCC CTC CCC CTC AAC CAC CTC CCT CCG ATC 23S2
Pro Phe Cln Gin Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro Cly Met
770 775 780
CCC CAC ACC CAC CTC CGC ATC CCG CAC CTC AAC CTC CCG CCC AAC CCC 2400
Pro Asp Thr His Leu Cly He Gly His Leu Asn Val Ala Ala Lys Pro
785 790 79S 800
CAC ATG CCC CCC CTC COT CGC CCC CGC CCG CTQ CCC TTT CAC ACT CCC 2448
Clu Hat Ala Ala Leu Cly Cly Gly Cly Arg Leu Ala Phe Clu Thr Cly
80S 810 815
CCA CCT CCT CTC TCC CAC CTC CCT CTC CCC TCT CCC ACC ACC ACC CTC 2496
Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Cly Thr Ser Thr Val
620 825 830
CTG CCC TCC ACC ACC CCA CCC GCC CTC AAT TTC ACT CTC CCC CCG TCC 2S44
Leu Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr Val Cly Cly Ser
835 640 845
ACC ACT TTC AAT CCT CAA TCC CAC TCG CTC TCC CCC CTC CAG ACC CGC 2S92
Thr Ser Leu Asn Gly Gin Cys Clu Trp Leu Ser Arg Leu Cln Ser Gly
8S0 655 860
ATC CTC CCC AAC CAA TAC AAC CCT CTC CGC CCC ACT CTC CCA CCA CCC 2640
Met Val Pro Asn Cln Tyr Asn Pro Leu Arg Cly Ser Val Ala Pro Cly
865 070 87S 880
163
CCC CTC ACC ACA CAC GCC CCC TCC CTC CAC CAT CCC ATC CTA GCC CCC 2688
Pro Leu Ser Thr Gin Ala Pro Ser Leu cln Hls cly Met val Cly Pro
885 890 895
CTC CAC ACT ACC CTT CCT CCC ACC GCC CTG TCC CAG ATC ATC ACC TAC 2736
Leu Hie Ser Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ser Cln Met Met Ser Tyr
900 90S 910
CAC CCC CTC CCC ACC ACC CCC CTC CCC ACC CAC CCT CAC CTC CTC CAC 2784
Cln Cly Leu Pro ser Thr Arg Leu Ala Thr Cln Pro His Leu Val cln
91S 920 92S
ACC CAG CAC CTC CAC CCA CAA AAC TTA CAC ATC CAG CAC CAC AAC CTC 2832
Thr Cln Cln Val Cln Pro Cln Asn Leu Cln Met Cln Gin Gin Asn Leu
930 93S 940
CAC CCA CCA AAC ATC CAC CAC CAC CAA AGC CTC CAC CCC CCA CCA CCA 2880
Cln Pro Ala Asn He Cln Gin Cln Gin Ser Leu Cln Pro Pro Pro Pro
945 9S0 955 960
CCA CCA CAO CCC CAC CTT CGC GTC ACC TCA CCA CCC ACC CCC CAC CTC 2928
Pro Pro Cln Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Cly His Leu
965 970 975
CCC CCG ACC TTC CTC AGT CCA GAC CCC AGC CAG CCA GAC CTC CAC CCA 2976
Cly Arg Ser Phe Leu Ser Gly Clu Pro Ser Gin Ala Asp Val Gin Pro
980 98S 990
CTC CCC CCC AGC ACC CTC CCC CTC CAC ACT ATT CTC CCC CAC CAG ACC 3024
Leu Cly Pro Ser Ser Leu Ala Val His Thr He Leu pro Cln Clu Ser
99S 1000 1005
CCC CCC CTC CCC ACC TCC CTC CCA TCC TCC CTC CTC CCA CCC CTC ACC 3072
Pro Ala Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro Val Thr
1010 1015 1020
CCA CCC CAC TTC CTC ACC CCC CCC TCC'CAC CAC AGC TAC TCC TCC CCT 3120
Ala Ala Cln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gin His Ser Tyr Ser Ser Pro
1025 1030 103S 1040
CTC CAC AAC ACC CCC ACC CAC CAC CTA CAC CTG CCT GTT CCT CTA ATC 3168
Val Asp Asn Thr Pro Ser His Cln Leu Gin Val Pro Val Pro Val Met
104S 1050 105S
GTA ATG ATC CGA TCT TCC CAT CCT TCT AAA CGC TCA TCA ATT TTC ATC 3216
Val Met lie Arg Ser Ser Asp Pro Ser Lys Cly Ser Ser He Leu He
1060 1065 1070
CAA GCT CCC GAC TCA TGG 3234
Clu Ala Pro Asp Ser Trp
1075
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 11 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 1078 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine
10
164
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 11 :
Cys Gin Clu Asp Ala Gly Asn Lys Val Cys Ser Leu Gin Cys Asn Aan
15 10 15
165
His Ala Cys Cly Trp Asp Cly Cly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp
20 2S 30
Pro Trp Lys Asn Cys Thr Cln Ser Leu Cln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser
35 40 45
Asp Gly His Cys Asp Ser Cln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp
SO SS 60
Gly Phe Asp Cya Cln Arg Ala Clu cly Cln cys Asn Pro Leu Tyr Asp
6S 70 7S 80
Gin Tyr Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Cly His Cys Asp Gin Gly Cys
85 90 95
Asn Ser Ala Clu Cys Clu Trp Asp Cly Leu Asp Cys Ala Clu His Val
100 105 110
Pro Clu Arg Leu Ala Ala Cly Thr Leu Val val Val Val Leu Met Pro
US 120 12S
Pro Glu Gin Leu Arg Asn Ser Ser Phe His Phe Leu Arg Clu Leu Set
130 13S 140
Arg Val Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg Asp Ala His Gly Gin
14S 150 1S5 160
Gin Met He Phe Pro Tyr Tyr Gly Arg Glu Clu Clu Leu Arg Lys Hls
16S 170 17S
Pro Ile Lys Arg Ala Ala Glu Gly Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu
180 18S 190
Gly Gin Val Lys Ala Ser Leu Leu Pro cly Gly Ser Clu Gly Cly Arg
195 200 205
Arg Arg Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp val Arg Gly Ser He Val Tyr
210 21S 220
Leu Glu He Asp Asn Arg Gin Cys Val Cln Ala Ser Ser Gin Cys Phe
225 230 235 240
Gin Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ser Leu
245 250 255
Gly Ser Leu Asn He Pro Tyr Lys He Clu Ala Val Cln Ser du Thr
260 265 270
Val Glu Pro Pro Pro Pro Ala Gin Leu His Phe Met Tyr Val Ala Ala
275 280 28S
Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly Val Leu Leu Ser
290 295 300
Arg Lys Arg Arg Arg Gin His Cly Cln Leu Trp Phe Pro clu Gly Phe
305 310 31S 320
Lys Val Ser Glu Ala Ser Lys Lya Lys Arg Arg Clu Pro Leu Cly Clu
32S 330 33S
Asp Ser Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Gly Ala Leu
340 34S 350
Met Asp Asp Asn Gin Asn Glu Trp Cly Asp Clu Asp Leu Clu Thr Lys
35S 360 365
Lys Phe Arg Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro Aap Leu Asp Asp Gin
166
370
37S
380
Thr Asp His Arg Gin Trp Thr Cln Cln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu
385 390 39S 400
Arg Het Ser Ala Mec Ala Pro Thr Pro Pro Gin Cly Clu Val Asp Ala
405 410 415
Asp Cys Met Asp Val Asn Val Arg Cly Pro Asp Cly Phe Thr Pro Lou
420 42S 430
Met He Ala Ser Cys Ser Oly Cly Gly Leu Clu Thr Gly Asn Ser Clu
43S 440 445
Clu Clu Clu Asp Ala Pro Ala Val He Ser Asp Phe He Tyr Cln Gly
450 455 460
Ala Ser Leu His Asn Gin Thr Aap Arg Ihr Gly clu Thr Ala Leu His
465 470 47S 480
Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu
485 490 495
Ala Ser Ala Asp Ala Asn He Gin Asp Asn Met Cly Arg Thr Pro Leu
S00 SOS 510
His Ala Ala Val Ser Ala Asp Ala Gin cly Val Phe Gin He Leu He
SIS 520 S2S
Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp cly Thr Thr..
530 535 540
Pro Leu He Leu Ala Ala Arg Leu Ala val Clu Cly Met Leu Clu Asp
54S SSO SSS S60
Leu He Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu Gly Lys
S6S S70 S7S
Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Asp Ala Ala Val
580 S8S 590
Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Cln Asn Asn Arg Glu
S9S 600 60S
Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Thr Ala
610 615 620
Lys Val Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp He Thr Asp His Met
625 630 635 640
Asp Arg Leu Pro Arg Asp He Ala Cln Clu Arg Mot His His Asp He
64S 650 655
Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gin Leu His
660 665 670
Gly Ala Pro Leu Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser
67S 680 685
Pro Asn Gly Tyr Leu Gly Ser Leu Lys Pro Gly Val Gin Gly Lys Lys
690 695 700
Val Arg Lys Pro Ser Ser Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Clu Ala
70S 710 71S 720
Lys Asp Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gin Asp Cly Lys Gly Cys
725 730 73S
167
Leu Leu Aflp Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser
740 745 750
Pro Hie Gly Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu Pro Ser
755 760 76S
Pro Phe Cln Gin Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro Gly Met
770 77S 780
Pro Asp Thr His Leu Gly He Cly His Leu Asn Val Ala Ala Lys Pro
78S 790 795 800
Glu Met Ala Ala Leu Gly Gly Cly Cly Arg Leu Ala Phe Clu Thr Gly
805 810 81S
Pro Pro Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Gly Thr Ser Thr Val
820 82S 830
Leu Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr Val Gly cly Ser
635 840 845
Thr Ser Leu Asn Gly Gin Cys clu Trp Leu Ser Arg Leu Gin Ser Gly
850 855 860
Met Val Pro Asn Gin Tyr Asn Pro Leu Arg Gly Ser Val Ala Pro Gly
86S 870 875 880
Pro Leu Ser Thr Gin Ala Pro Ser Leu Gin His Gly Met Val Gly Pro
885 890 895
Leu His Ser Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ser Gin Met Met Ser Tyr
900 90S 910
Gin Gly Leu Pro Ser Thr Arg Leu Ala Thr Gin Pro His Leu Val Gin
915 920 925
Thr Gin Gin Val Gin Pro Cln Asn Leu cln Met Cln Gin Gin Asn Leu
930 935 940
Gin Pro Ala Asn He Gin Gin Gin Gin Ser Leu Gin Pro Pro Pro Pro
945 950 955 960
Pro Pro Gin Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu
965 970 975
Cly Arg Ser Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gin Ala Asp Val Gin Pro
960 985 990
Leu Gly Pro Ser Ser Leu Ala Val His Thr He Leu Pro Gin Glu Ser
995 1000 1005
Pro Ala Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro Val Thr
1010 1015 1020
Ala Ala Gin Phe Leu Thr Pro Pro Ser Cln His Ser Tyr Ser Ser Pro
1025 * 1030 103S 1040
Val Asp Asn Thr Pro ser Hie Cln Leu Gin Val Pro Val Pro Val Met
104S 1050 10SS
Val Met He Arg Ser Ser Asp Pro Ser Lys Gly Ser Ser He Leu He
1060 1065 1070
Clu Ala Pro Asp Ser Trp
1075
168
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 12
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
5 (A) LONGUEUR : 4268 paires de bases
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
10 (ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE :
(A) NOM/CLE : CDS
(B) EMPLACEMENT : 2...1972
15
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 12
169
G GAC CTC CAT CTC TTA CAT CTG AAT CTC CGT CCC CCA CAT CCC TCC
Clu Val Asp Val Leu Asp val Asn Val Arg Cly Pro Asp Cly Cys
1 5 10 IS
46
ACC CCA TTG ATC TTC CCT TCT CTC CGA CGA CCC ACC TCA CAT TTG ACT
Thr Pro Leu Met Leu Ala Ser Leu Arg Cly Gly Ser Ser Asp Leu Ser
20 25 30
94
CAT CAA CAT CAA CAT CCA CAG CAC TCT TCT CCT AAC ATC ATC ACA GAC
Asp Clu Asp Clu Asp Ala clu Asp Ser Ser Ala Asn He He Thr Asp
3S 40 45
142
TTC CTC TAC CAC CCT CCC ACC CTC CAC CCC CAC ACA CAC CCC ACT GGT
Leu Val Tyr Cln Cly Ala Ser.Leu Cln Ala Gin Thr Asp Arg Thr Cly
SO SS 60
190
CAC ATC CCC CTG CAC CTT CCA CCC CCC TAC TCA CCC CCT CAT CCT CCC
Clu Met Ala Leu His Lau Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ala Asp Ala Ala
65 70 75
238
AAC CCT CTC CTC GAT GCA CGT CCA CAT CCC AAT CCC CAC CAC AAC ATC
Lys Arg Leu Leu Asp Ala Cly Ala Asp Ala Asn Ala Cln Asp Asn Met
80 85 90 95
266
CGC CCC TCT CCA CTC CAT CCT CCA CTC CCA GCT CAT CCC CAA CGT CTC
cly Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Cln Gly Val
100 105 HO
334
TTC CAC ATT CTC ATT CGC AAC CCA CTA ACT CAT CTA CAT CCC ACG ATC
Phe Gin He Leu He Arg Aan Arg Val Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met
HS 120 125
362
AAT CAT CGT ACT ACA CCC CTC ATC CTG CCT CCC CCC CTC CCT CTC GAC
Asn Asp Gly Thr Thr Pro Leu He Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu
130 13$ 140
430
CCA ATG GTG CCA GAA CTG ATC AAC TCC CAA GCC GAT CTC AAT CCA CTC
Gly Met Val Ala Clu Leu He Asn Cys Cln Ala Asp Val Asn Ala Val
145 ISO 155
478
CAT CAC CAT CGA AAA TCT CCT CTT CAC TCC CCA CCT GCT CTC AAT AAT
Asp Asp His Cly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn
160 16$ 170 17S
526
GTC CAC CCA ACT CTT TTC TTC TTC AAA AAT CCC CCC AAC CCA CAC ATC
Val Clu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Lys Asn Gly Ala Asn Arg Asp Met
180 18S 190
574
CAG GAC AAC AAC CAA CAC ACA CCT CTC TTT CTT CCT CCC CCC CAG CCC
Cln Asp Asn Lys Clu Clu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Clu Cly
195 200 205
622
170
ACC TAT CAA GCA CCC AAC ATC CTC TTA GAC CAT TTT CCC AAT CCA GAC 670
Ser Tyr Clu Ala Ala Lys He Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp
210 21S 220
ATC ACA CAC CAT ATC CAT CCT CTT CCC CCC CAT CTC CCT CCG CAT CCC 718
He Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp Val Ala Arg Asp Arg
225 230 235
ATC CAC CAT CAC ATT CTC CCC CTT CTC CAT CAA TAC AAT CTG ACC CCA 766
Met His His Asp He Val Arg Leu Leu Asp Clu Tyr Asn Val Thr Pro
240 245 250 255
ACC CCT CCA CCC ACC CTC TTC ACT TCT GCT CTC TCA CCT GTC ATC TCT 814
Ser Pro Pro Cly Thr Val Leu Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val He Cys
260 265 270
CCC CCC AAC ACA TCT TTC CTC AGC CTC AAC CAC ACC CCA ATC CCC AAC 862
Cly Pro Asn Arg Ser Phe Leu Ser Leu Lys His Thr Pro Het Gly Lys
275 280 285
AAC TCT ACA CCC CCC ACT CCC AAC ACT ACC ATC CCT ACT ACC CTC CCT 910
Lys Ser Arg Arg Pro ser Ala Lys Ser Thr Met Pro Thr Ser Leu Pro
290 295 300
AAC CTT CCC AAC GAC CCA AAC CAT CCC AAC GCT ACT ACG AGC AAC AAC 958
Asn Leu Ala Lys Clu Ala Lys Asp Ala Lys Cly ser Arg Arg Lys Lys
305 310 315
TCT CTC ACT CAC AAC CTC CAA CTC TCT CAO AGT TCA GTA ACT TTA TCC 1006
Ser Leu Ser Clu Lys Val Cln Leu Ser Clu Ser Ser Val Thr Leu Ser
320 32S 330 335
CCT CTT GAT TCC CTA CAA TCT CCT CAC ACC TAT CTT TCC CAC ACC ACA 1054
Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro Hls Thr Tyr val Ser Asp Thr Thr
340 345 350
TCC TCT CCA ATC ATT ACA TCC CCT CCC ATC TTA CAC CCC TCA CCC AAC 1102
Ser Ser Pro Met He Thr Ser Pro Cly He Leu Cln Ala Ser Pro Aan
35S 360 365
CCT ATG TTC CCC ACT CCC CCC CCT CCT CCC CCA GTC CAT CCC CAC CAT 1150
Pro Met Lau Ala Thr Ala Ala Pro Pro Ala Pro Val His Ala Gin His
370 375 380
CCA CTA TCT TTT TCT AAC CTT CAT CAA ATC CAC CCT TTC CCA CAT GCC 1198
Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu His clu Het Cln Pro Leu Ala His cly
385 390 395
CCC ACC ACT GTG CTT CCC TCA CTC AGC CAG TTG CTA TCC CAC CAC CAC 1246
Ala Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser Cln Leu Leu Ser His His His
400 405 410 415
ATT CTC TCT CCA CGC ACT CCC ACT CCT CCA ACC TTC ACT ACG CTC CAT 1294.
He Val Sex Pro Gly Ser Gly Ser ALa cly Ser Leu Ser Arg Leu His
420 425 430
CCA CTC CCA CTC CCA CCA CAT TCC ATC AAC CCC ATC CAC CTC AAT GAC 1342
Pro Val Pro Val Pro Ala Asp Trp Met Asn Arg Met clu Val Asn clu
43S 440 44S
ACC CAC TAC AAT CAC ATC TTT CCT ATC CTC CTC CCT CCA CCT CAC CGC 1390
Thr Gin Tyr Asn Clu Met Phe Cly Met Val Leu Ala Pro Ala Clu Cly
450 455 460
ACC CAT CCT CCC ATA CCT CCC CAO AGC AGC CCA CCT CAA CGC AAG CAC 1438
Thr His Pro Oly He Ala Pro Cln Ser Arg Pro Pro Clu Cly Lys His
46S 470 475
171
ATA ACC ACC CCT CGC GAC CCC TTC CCC CCC ATT CTC ACT TTC CAC CTC I486
He Thr Thr Pro Arg Clu Pro Leu Pro Pro He Val Thr Phe ein Leu
480 48S 490 495
ATC CCT AAA GCC ACT ATT CCC CAA CCA CCC CGC CCT CCC CAG CCT CAG 1534
He Pro Lys Cly Ser He Ala Cln Pro Ala Cly Ala Pro Cln Pro Cln
500 SOS S10
TCC ACC TCC CCT CCA CCT CTT CCC CCC CCC CTG CCC ACC ATC TAC CAG 1S82
Ser Thr Cyo Pro Pro Ala Val Ala Cly Pro Leu Pro Thr Met Tyr cln
SIS 520 525
ATT CCA GAA ATC CCC CGT TTC CCC ACT CTC CCT TTC CCC ACT CCC ATG 1630
He Pro Clu Het Ala Arg Leu Pro Ser Val Ala Phe Pro Thr Ala Met
530 535 540
ATC CCC CAC CAC CAC CCC CAG CTA CCT CAG ACC ATT CTC CCA CCC TAT 1678
Met Pro Cln Cln Asp Gly ein Val Ala Cln Thr He Leu Pro Ala Tyr
S4S 550 555
CAT CCT TTC CCA CCC TCT CTC CGC AAG TAC CCC ACA CCC CCT TCA CAO 1726
His Pro Phe Pro Ala Ser Val Cly Lys Tyr Pro Thr Pro Pro Ser Gin
560 565 S70 575
CAC ACT TAT GCT TCC TCA AAT GCT CCT CAG CCA ACA CCC ACT CAC ACT 1774
Hls Ser Tyr Ala Ser Ser Aan Ala Ala Glu Arg Thr Pro Ser His Ser
580 S8S 590
CCT CAC CTC CAC CGT GAG CAT CCC TAC CTC ACA CCA TCC CCA CAG TCT 1822
Cly Hie Leu Cln Cly du His Pro Tyr Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser
S9S 600 60S
CCT GAC CAG TGC TCA ACT TCA TCA CCC CAC TCT CCT TCT CAC TCC TCA 1870
Pro Asp Gin Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Ala Ser Asp Trp Ser
610 615 620
CA- GTC ACC ACC AGC CCT ACC CCT CGC CCT CCT CGA GCA CGT CAG CGC 1918
A«-. Val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Cly Cly Ala Cly Oly Cly Cln Arg
625 630 635
CGA CCT GCC ACA CAC ATC TCT CAC CCA CCA CAC AAC AAC ATC CAC CTT 1966
Cly Pro Gly Thr His Met Ser Glu Pro Pro His Asn Asn Met Gin Val
640 645 650 6SS
TAT CCG TGACACACTC CACCTCCACT CTACAGACAT AACTGACTTT TCTAAATCCT 2022
Tyr Ala
CCTCAGCAAC AAATGAACGT CATCCCGGAG
TACAGCTACC AAACACAACA TCTTCTTATT
TTCACTCGCT ATCTCCAACC CTTATTCATT
ATCCAAGATG AATACAAGCC TTCCCTCCAT
CCATGCTTAT TCAAGCCCAG ACATTCTTCC
TTCTCCCATA TCCATCAGAA GATTCTACAC
TTCTCCCTCA ATTCACCTAC CCATCTCCTC
TCCTTTTCCT TTTCCACCTC TCCOTCATTC
CTTTCTCCTT TTCATCATTC TCCCCCATCA
CTTCCCCCTA TCCCTTCCAC TCTCACAACC
ACAAATCAAG AAATCTCTGG AGCCACCTTC 2082
CACATAATCC AACACAACCA ATTCCTCACT 2142
ATTCTAATCT AATAACACAA GTTTCTCGAA 2202
CTTTACTCTC TTCTATTTCC ACAATAACAT 2262
ACCTTCCACT CCATTTTAAC CCCTCCACCC 2322
TACCCTCCTG TTCCGAATTA TCCCCTCCAA 2362
CTCCTTCCAC ATTCTTTTCT CTTCATTTCC 2442
TACCCCTACC ACCATCTTAT ACCCCAACAC 2502
AACCAACTTT CCTCTCCTTT CCCCTCCTCT 2S62
TTTACTTTCC TATCCTTCTC ACCACAAACC 2622
172
TTTCAAGTAT CTTCTTTCTT TCGAAAATCG ACATACTGTA TTCTGTTCTC CTGCATATAT 2682
CATTCCTCCA GAGAGAAGGG GAGAAGAATA CTTTTCTTCA ACAAATTTTG CCGCCAGGAG 2742
ATCCCTTCAA CACGCTCCAC CTTAATTTTT CTTGTCTCTG TGCAGCTCTT CATATAAACT 2802
TTACCACCAA GAACCCTGTC AGTTTGTTCT TTTTCTCTCT ATCCGCCTCG TCAGTGTAAA 2862
CTTTTATCCT TCATAGTCTA CTTACTATCA CCCTCCCCAC TTTTTTAAAA CCAGAAAAAG 2922
GTTTGGAATC TTCCAATCAC CAAGACACAA GTTAACTCCT CCAACACCCA CTTACCCACC 2982
CACACCTCCC CCTACTTCCT GCCAACCATT CCATTGACTC CCTCTATCCA ACACATTTGT 3042
CCCAGATCTG ACCATTCTAG CCCTGTTTCA CTCACTCACC CACCATATCA AACTAGTCTT 3102
AACTCTTCAC CCTTTCCTTT CATATCCACA GAAGACACTC TCTCAAATGT TGTACCCTTG 3162
CCATTTACCA CTCAACTTTC CTTAGCCCAA GCGACCCAGT CACACTTCTC TTCCCTTTCT 3222
CAGATCATCA GTCTCTACTC ATTATCTTCC TCCTTAAACC CCTGCTCACC AATCTTTCTT 3282
TCACACCGTC TCCTCCCTCT TACTCCTATA CCCAOTATCT TCTCACTGAA CACATGCACT 3342
TTATATCTTC AAGTCCACCA ATTCOAAACT TCGACTTCTT TTCTATCATC CAAAACACCC 3402
CTATAACAAC GTTCCAAAAC CACGAACTAT ATACCACCCT TTGCTATTTT CTCCTACCAT 3462
TTCTTTTCCT CTCAACCCCC CATOACATTC CCTTTGOCAA CTAACGTAGA AACTCAACAG 3522
AACATTTTCC TTTCCTACAG TCACCTTTTA CATCATAATC CACAACTATA CACTTCCTCA 3582
TTOTTCAGAC TGATTGCCCC TCACCTCAAT CCACTCTCTG TATTCATCCT CTTCCCAATT 3642
TCTTTGACTT TCTTTTAACC CCAGAAGCAT TTTACTTAAT TCTAGATAAA GAATAGTTTT 3702
CTTCCTCTTC TCCTTCCCCC AGTTAATAAT TGGTCCATGG CTACACTGCA ACTTCCGTCC 3762
ACTCCTGTCA TCCCCATCAC ACCTCCAAAA TAACTTCTGC CTCCGCATTT TCTAGATATT 3822
AACACCTCAA TTCCCGACTC TTTTCCTTTG AATCACACTT CTCATTCCTT CTATGCCTCC 3882
AACTATCCAT CAGTCCTTCC CACTTACCTC ATTTCTCTCT CCGTCCCCCC ATATGGAAAC 3942
CCTGCCTCTC TGTTCGCATA ATACTTTACA AATCCTTTTT TCACTCCTAT CCAAATTTAT 4002
TCAACCAACA AAAATAATTA CTTCTCCCCT CACATAACCA CATTAACTTT CTTCATTCTC 4062
TGCTTTATTC TCTCCATCTC CCAACATTCT CTCACCCTCT TTCATACTCT GCAAACATTT 4122
TATCATTCTA AATCCTGACT CTCTCCCCTT CGACCCATTT ATTATTCACA CATCGCCAGA 4182
ACCTATCTCC ATCCACCCTC ACCATCCTCT CTCCACCACA CACACTGCAG GCAGCCACTG 4242*
CCCATCOCOA TGACTTTCTT CCCCTC 4268
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 13 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 657 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : protéine
173
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 13
Clu Val Asp Val Leu Asp Val Asn Val Arg Cly Pro Asp Cly Cys Thr
15 10 15
Pro Leu Het Leu Ala Ser Leu Arg Cly Cly Ser Ser Asp Leu Ser Asp
20 2S 30
Clu Asp Clu Asp Ala Clu Asp Ser Ser Ala Asn He He Thr Asp Leu
35 40 4S
Val Tyr Cln Cly Ala Ser Leu Cln Ala Cln Thr Asp Arg Thr Gly Clu
SO SS 60
Het Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ala Asp Ala Ala Lys
65 70 75 80
Arg Leu Leu Asp Ala Cly Ala Asp Ala Asn Ala Cln Asp Asn Het Gly
85 90 95
Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Gin Gly Val Phe
100 105 110
Cln He Leu He Arg Asn Arg Val Thr Asp Leu Asp Ala Arg Het Asn
115 120 12S
Asp Cly Thr Thr Pro Leu He Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly
130 13S 140
Met Val Ala Glu Leu He Asn Cys Cln Ala Asp Val Asn Ala Val Asp
145 150 155 160
Asp Hiß Cly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn val
165 170 17S
Glu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Lya Asn cly Ala Asn Arg Asp Het Cln
180 185 190
Asp Asn Lys Clu Clu Thr Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Clu Cly Ser
195 200 205
Tyr Clu Ala Ala Lys He Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp He
210 215 220
Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp Val Ala Arg Asp Arg Met
225 230 235 240
His His Asp He Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Val Thr Pro Ser
245 2S0 2S5
Pro Pro Cly Thr Val Leu Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val He Cys Gly
260 265 270
Pro Asn Arg Ser Phe Leu Ser Leu Lys His Thr Pro Met Cly Lys Lys
275 280 285
Ser Arg Arg Pro Ser Ala Lye Ser Thr Met Pro Thr Ser Leu Pro Asn
290 295 300
Leu Ala Lye Clu Ala Lye Asp Ala Lys Cly Ser Arg Arg Lys Lys Ser
30S 310 315 320
Leu Ser Glu Lys val Gin Leu Ser Clu Ser Ser val Thr Leu Ser Pro
325 330 335
Val Asp Ser Leu Clu Ser Pro His Thr Tyr Val Ser Asp Thr Thr Ser
340 34S 350
Ser Pro Met Ile Thr Ser Pro Cly Ile Leu Cln Ala Ser Pro Asn Pro
174
35S 360 365
Met Leu Ala Thr Ala Ala Pro Pro Ala Pro Val His Ala Gin His Ala
370 37S 380
Leu Ser Phe Ser Asn Leu His Clu Met Gin Pro Leu Ala His Gly Ala
385 390 39S 400
Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser Gin Leu Leu Ser His His His He
40S 410 415
Val Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ala Cly Ser Leu Ser Arg Leu His Pro
420 425 430
Val Pro Val Pro Ala Asp Trp Met Asn Arg Met Glu Val Asn Glu Thr
435 440 44S
Gin Tyr Asn Clu Met Phe Gly Met Val Leu Ala Pro Ala Clu Cly Thr
450 455 460
His Pro Gly He Ala Pro Gin Ser Arg Pro Pro Glu Gly Lys His He
465 470 47S 480
Thr Thr Pro Arg Glu Pro Leu Pro Pro He Val Thr Phe Gin Leu He
485 490 495
Pro Lys Gly Ser He Ala Cln Pro Ala Gly Ala Pro Gin Pro Gin Ser
500 505 510
Thr Cys Pro Pro Ala Val Ala Gly Pro Leu Pro Thr Met Tyr Gin He
515 520 525
Pro Glu Met Ala Arg Leu Pro Ser Val Ala Phe Pro Thr Ala Met Met
530 535 540
Pro Gin Gin Asp Gly Gin Val Ala Gin Thr He Leu Pro Ala Tyr Hie
545 550 SSS 5.60
Pro Phe Pro Ala Ser val Cly Lys Tyr Pro Thr Pro Pro ser cln His
565 S70 575
Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Ala Ala Clu Arg Thr Pro Ser His Ser Gly
580 585 S90
His Leu Cln Gly Clu His Pro Tyr Leu Thr Pro Soc Pro Glu Ser Pro
S9S 600 605
Asp Gin Trp' Ser Ser Ser Ser Pro His ser Ala Ser Asp Trp Ser Asp
610 61S 620
Val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gin Arg Cly
625 630 635 640
Pro Cly Thr His Met Ser Glu Pro Pro His Asn Asn Met Gin Val Tyr
645 650 655
Ala
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 14
175
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 77 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
5 (C) TYPE DE BRIN : simple
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
10 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 14
Glu Asp Ile Asp Glu Cys Asp Gin Gly Ser Pro Cys Glu His Asn Gly
15 10 15
Ile Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Asn cys Ser Gin Gly
20 25 30
Phe Thr Gly Pro Arg Cys Clu Thr Asn Ile Acn Glu Cys Clu Set Kis
35 40 45
Pro Cys Gin Asn Clu Gly Ser Cys Leu Asp Asp Pro Gly Thr Phe Arg
SO SS 60
Cys Val Cys Met Pro Cly Phe Thr Gly Thr Cln Cys Glu
6S 70 75
15
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 15
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 78 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
(C) TYPE DE BRIN : simple
20 (D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 15
176
10
Asn Asp Val Asp Glu Cys Ser Leu Gly Ala Asn Pro Cys Glu His Gly
1 5 10 15
Gly Arg Cys Thr Asn Thr Leu Gly Ser Phe Gin Cys Asn Cys Pro Gin
20 25 30
Gly Tyr Ala Gly Pro Arg Cys Glu Ile Asp Val Asn Glu Cys Leu Ser
35 40 45
Asn Pro Cys Gin Asn Asp Ser Thr Cys Leu Asp Gin Ile Gly Glu Phe
50 55 60
Cln Cys* Ile Cys Met Pro Gly Tyr Glu Gly Leu Tyr Cys Glu
65 70 75
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 16 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 654 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
(C) TYPE DE BRIN : simple
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 16 :
Thr Pro Pro Gin Gly Glu Ile Glu Ala Asp Cys Met Asp Val Asn Val
15
177
10
IS
Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met He Ala Ser Cys Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Leu Clu Thr Cly Asn Ser Clu Clu Clu clu Asp Ala Ser Ala
35 40 45
Asn Met He Ser Asp Phe He Cly Cln Cly Ala Gin Leu His Asn Gin
SO SS 60
Thr Asp Arg Thr Cly Clu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Arg Ala Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu Ser Ser Ala Asp Ala Asn
65 90 95
Val Cln Asp Asn Met Cly Arg Thr Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala
100 105 110
Asp Ala Gin Cly Val Phe Cln He Leu He Arg Asn Arg Ala Thr Asp
115 120 125
Leu Asp Ala Arg Met Phe Asp Gly Thr Thr Pro Leu He Leu Ala Ala
130 135 140
Arg Leu Ala Val Glu Cly Met Val Glu Glu Leu He Asn Ala His Ala
145 ISO 15S 160
Asp Vàl Asn Ala Val Asp Clu Phe Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala
16S 170 175
Ala Ala Val Asn Asn Val Asp Ala Ala Ala Val Leu Leu Lys Asn Ser
180 IBS 190
Ala Asn Lys Asp Met Gin Asn Asn Lys Glu Clu Thr Ser Leu Phe Leu
19S 200 205
Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Clu Thr Ala Lys Val Leu Leu Asp His
210 21S 220
Tyr Ala Asn Arg Asp He Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp
225 230 23S 240
He Ala Gin Glu Arg Met His His Asp He Val His Leu Leu Asp Glu
245 250 255
Tyr Asn Leu Val Lys Ser Pro Thr Leu His Asn Cly Pro Leu Cly Ala
260 265 270
Thr Thr Leu Ser Pro Pro He Cys Ser Pro Asn Gly Tyr Met Gly Asn
275 280 285
Met Lys Pro ser Val cln Ser Lys Lys Ala Arg Lys Pro Ser He Lys
290 29S 300
Gly Asn Gly Cys Lys Glu Ala Lys Clu Leu Lys Ala Arg Arg Lye Lys
305 310 315 320
Ser Gin Asp Cly Lys Thr Thr Leu Leu Asp Ser Cly Ser Ser Gly Val
325 330 335
Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Clu Ser Thr His Gly Tyr Leu Ser Asp
340 345 350
Val Ser Ser Pro Pro Leu Met Thr Ser Pro Phe Gin Gin Ser Pro Ser
3SS 360 36S
178
Met Pro Leu Asn His Leu Thr Ser Met Pro Clu Ser Cln Leu Cly Met
370 375 380
Asn His He Asn Met Ala Thr Lys Cln Clu Met Ala Ala Gly Ser Asn
385 390 395 400
Arg Met Ala Phe Asp Ala Met Val Pro Arg Leu Thr His Leu Asn Ala
405 410 415
Ser Ser Pro Asn Thr He Met Ser Asn Cly Ser Met His Phe Thr Val
420 425 430
Gly Gly Ala Pro Thr Met Asn Ser Gin Cys Asp Trp Leu Ala Arg Leu
43S 440 445
Cln Asn Cly Met Val Gin Asn Cln Tyr Asp Pro He Arg Asn Gly He
450 45S 460
Gin Gin Gly Asn Ala Gin Gin Ala Gin Ala Leu Gin His Gly Leu Met
46S 470 475 480
Thr Ser Leu Hie Asn Gly Leu Pro Ala Thr Thr Leu Ser Gin Met Het
485 490 495
Thr Tyr Gin Ala Met Pro Asn Thr Arg Leu Ala Asn Gin Pro His Leu
500 S05 510
Met Gin Ala Gin Gin Met Gin Gin Gin Gin Asn Leu Gin Leu His Gin
515 520 S25
Ser Met Gin Gin Gin Hls Hls Asn Ser Ser Thr Thr Ser Thr His He
530 535 540
Asn Ser Pro Phe Cys Ser Ser Asp He Ser Gin Thr Asp Leu Gin Gin
54S 550 555 560
Met Ser Ser Asn Asn He His Ser Val Met Pro Gin Asp Thr Gin He
565 570 S7S
Phe Ala Ala Ser Leu Pro Ser Asn Leu Thr Gin Ser Met Thr Thr Ala
580 585 590
Gin Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gin His Ser Tyr Ser Ser Pro Met Asp
59S ? 600 60S
Asn Thr Pro Ser Hls Cln Leu Gin Val Pro Asp His Pro Phe Leu Thr
610 615 620
Pro Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gin Trp Ser Ser Ser Ser Pro Hie Ser
625 630 635 640
Asn Het Ser Asp Trp Ser Clu Gly He Ser Ser Pro Pro Thr
645 6S0
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 17 :
179
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 666 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 17
10
180
Thr Pro Pro Gin Cly Clu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp Val Asn Val
IS 10 is
Arg Cly Pro Asp Cly Phe Thr Pro Leu Met He Ala Ser Cys Ser cly
20 25 30
Gly Gly Leu Clu Thr Cly Asn Ser Glu Glu Glu Clu Asp Ala Pro Ala
3S 40 45
val He Ser Asp Phe He Tyr Cln Cly Ala Ser Leu His Asn cln Thr
50 SS 60
Asp Arg Thr Gly Clu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg
6S 70 75 80
Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Clu Ala Ser Ala Asp Ala Asn He
85 90 95
Gin Asp Asn Met Gly Arg Thr Pro Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp
100 10S Ho
Ala Cln Gly Val Phe Gin He Leu Leu Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu
US 120 125
Asp Ala Arg Met His Asp Cly Thr Thr Pro Leu He Leu Ala Ala Arg
130 13S 140
Leu Ala Val Clu Gly Met Leu Clu Asp Leu He Asn Ser His Ala Asp
145 150 155 160
Val Asn Ala Val Asp Asp Leu Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala Ala
165 170 175
Ala Val Asn Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Cly Ala
180 185 190
Asn Lys Asp Met Cln Asn Asn Lys Glu Clu Thr Pro Leu Phe Leu Ala
195 200 20S
Ala Arg Glu Gly ser Tyr clu Thr Ala Lys val Leu Leu Asp His Phe
210 215 220
Ala Asn Arg Asp He Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp He
225 230 235 240
Ala Gin «lu Arg Met His His Asp He Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr
245 250 255
Asn Leu Val Arg Ser Pro Cln Leu His Gly Thr Ala Leu Gly Cly Thr
260 265 27Ö
Pro Thr Leu Ser Pro Thr Leu Cys ser Pro Asn Cly Tyr Leu Cly Asn
275 280 28S
Leu Lys Ser Ala Thr Cln Gly Lys Lys Ala Arg Lys Pro Ser Thr Lys
290 29S 300
Gly Leu Ala Cys Ser Ser Lys Glu Ala Lys Asp Leu Lys Ala Arg Arg
305 310 315 320
Lya Lys Ser Gin Asp Cly Lys Gly Cys Leu Leu Asp Ser Ser Ser Met
325 330 335
Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Gly Tyr Leu Ser Asp
340 345 3S0
Val Ala Ser Pro pro Leu Pro Ser Pro Phe Gin Gin Ser Pro Ser Met
181
3SS 360 365
Pro Leu Ser His Leu Pro Gly Met Pro Asp Thr His Leu Cly He Ser
370 375 380
His Leu Asn val Ala Ala Lys Pro Clu Met Ala Ala Leu Ala Gly Gly
385 390 395 400
Ser Arg Leu Ala Phe Glu Pro Pro Pro Pro Arg Leu Ser Hie Leu Pro
405 410 415
Val Ala Ser Ser Ala Ser Thr Val Leu Ser Thr Asn Gly Thr Gly Ala
420 425 430
Met Asn Phe Thr Val Gly Ala Pro Ala Ser Leu Asn Gly Gin Cys Glu
435 440 445
Trp Leu Pro Arg Leu Cln Asn Gly Met Val Pro Ser Cln Tyr Asn Pro
450 455 460
Leu Arg Pro Gly Val Thr Pro Gly Thr Leu Ser Thr Cln Ala Ala Gly
465 470 475 480
Leu Gin His Gly Met Met Ser Pro He His Ser Ser Leu Ser Thr Asn
485 490 495
Thr Leu Ser Pro He He Tyr Gin Gly Leu Pro Asn Thr Arg Leu Ala
500 SOS S10
Thr Gin Pro His Leu Val Cln Thr Gin Gin Val Gin Pro Gin Asn Leu
515 S20 525
Gin He Gin Pro Gin Asn Leu Gin Pro Pro Ser Gin Pro His Leu Ser
530 535 540
Val Ser Ser Ala Ala Asn Gly His Leu Gly Arg Ser Phe Leu Ser Gly
545 550 555 560
Glu Pro Ser Gin Ala Asp Val Gin Pro Leu Gly Pro Ser Ser Leu Pro
565 570 575
Val His Thr He Leu Pro Gin Clu Ser Gin Ala Leu Pro Thr Ser Leu
580 585 590
Pro Ser Ser Met Val Pro Pro Met Thr Thr Thr Gin Phe Leu Thr Pro
595 600 605
Pro Ser Gin His Ser Tyr Ser Ser Ser Pro Val Asp Asn Thr Pro Ser
610 61S 620
His Gin Leu Gin Val Pro Clu His Pro Phe Leu Thr Pro ser Pro Glu
62S 630 635 640
Ser Pro Asp Gin Trp Ser Ser Ser Ser Arg His Ser Asn He Ser Asp
645 650 655
Trp Ser Glu Gly He Ser Ser Pro Pro Thr
660 665
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 18
182
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 681 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
5 (C) TYPE DE BRIN : simple
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
10 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 18
183
Thr Pro Pro Gin Gly Clu Val Asp Ala Asp Cys Met Asp Val Asn Val
IS 10 15
Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met He Ala Ser Cys Ser Gly
20 25 30
Cly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Clu Clu Clu Clu Asp Ala Pro Ala
3S 40 45
Val He Ser Asp Phe He Tyr Cln Gly Ala Ser Leu His Asn Gin Thr
SO 55 60
Asp Arg Thr Gly Clu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg
65 70 75 80
Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu Ala Ser Ala Asp Ala Asn He
85 90 95
Gin Asp Asn Met Gly Arg Thr Pro Leu His Ala Ala Val Ser Ala Asp
100 105 110
Ala Gin Gly Val Phe Gin He Leu He Arg Asn Arg Ala Thr Asp Leu
115 120 125
Asp Ala Arg Met His Asp Gly Thr Thr Pro Leu He Leu Ala Ala Arg
130 13S 140
Leu Ala Val Clu Gly Met Leu Glu Asp Leu He Asn Ser His Ala Asp
145 ISO 15S 160
Val Asn Ala Val Asp Asp Leu Gly Lys Ser Ala Leu His Trp.Ala Ala
165 170 175
Ala Val Asn Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu Leu Lys Asn Gly Ala
180 185 ISC
Asn Lys Asp Met Gin Asn Asn Arg Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu Ala
195 200 205
Ala Arg Clu Gly Ser Tyr Clu Thr Ala Lye Val Leu Leu Asp His Phe
210 215 220
Ala Asn Arg Asp He Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp He
225 230 235 240
Ala Gin Clu Arg Met His His Asp He val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr
245 250 255
Asn Leu Val Arg Ser Pro Gin Leu His Gly Ala Pro Leu Gly Gly Thr
260 265 270
Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser Pro Asn Gly Tyr Leu Gly Ser
275 280 265
Leu Lys Pro Gly Val Gin cly Lys Lye Val Arg Lys Pro Ser ser Lys
290 295 300
Gly Leu Ala cys Gly Ser Lys clu Ala Lys Asp Leu Lys Ala Arg Arg
305 310 31S 320
Lys Lys Ser Gin Asp Gly Lys Cly Cys Leu Leu Asp Ser Ser Gly Met
184
325
3 JO
335
Leu Ser Pro Val A6p Sec Leu Clu Ser Pro His Gly Tyr Leu Ser Asp
340 34S 350
Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu Pro Ser Pro Phe Cln Gin Ser Pro Ser
3S5 360 365
Val Pro Leu Asn His Leu Pro Cly Met Pro Asp Thr His Leu Gly He
370 375 380
Cly His Leu Asn Val Ala Ala Lys Pro Clu Met Ala Ala Leu Gly cly
38S 390 39S 400
Gly Cly Arg Leu Ala Phe Glu Thr Gly Pro Pro Arg Leu Ser His Leu
40S 410 415
Pro val Ala Set Cly Thr Ser Thr Val Leu Cly Ser Ser Ser Cly Cly
420 425 430
Ala Leu Asn Phe Thr Val Gly Cly Ser Thr Ser Leu Asn Cly Gin Cys
435 440 445
Glu Trp Leu Ser Arg Leu Cln Ser Cly Met Val Pro Asn Cln Tyr Asn
450 455 460
Pro Leu Arg Cly Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu Ser Thr Cln Ala Pro
465 470 47S 480
Ser Leu Gin His Gly Met Val Cly Pro Leu His Ser ser Leu Ala Ala
485 490 495
Ser Ala Leu Ser Cln Met Met Ser Tyr Gin Gly Leu Pro Ser Thr Arg
500 SOS S10
Leu Ala Thr Cln Pro His Leu Val Gin Thr Gin Gin Val Cln Pro Gin
S15 520 52S
Asn Leu Gin Met Gin Gin Gin Asn Leu Gin Pro Ala Asn He Gin Gin
S30 535 540
Cln Cln Ser Leu Cln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cln Pro His Leu Gly
S4S 550 SSS S60
val Ser Ser Ala Ala ser Gly His Leu Gly Arg Ser Phe Leu Ser Cly
565 S70 S7S
Clu Pro Ser Gin Ala Asp Val Cln Pro Leu Cly Pro Ser Ser Leu Ala
560 58S 590
Val His Thr He Leu Pro Cln Clu Ser Pro Ala Leu Pro Thr Ser Leu
595 600 605
Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro Val Thr Ala Ala Gin Phe Leu Thr Pro
610 61S 620
Pro Ser Gin His Ser Tyr Ser Ser Pro Val Clu Asn Thr Pro Ser His
625 630 635 640
Gin Leu Gin Val Pro Clu His Pro Phe Leu Thr Pro Ser Pro Clu Ser
645 650 65S
Pro Asp Cln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Asn Val Ser Asp Trp
660 66S 670
Ser Glu Gly Val Ser Ser Pro Pro Thr
675 680
10
185
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 19 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 2471 paires de bases
(B) TYPE : acide aminé
(C) TYPE DE BRIN : simple
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 19
186
Met Pro Ala Leu Arg Pro Ala Leu Leu Trp Ala Leu Leu Ala Leu Trp
15 10 IS
Leu Cys Cys Ala Ala Pro Ala His Ala Leu Gin Cys Arg Aap Gly Tyr
20 25 30
Glu Pro Cys Val Asn Glu Gly Met Cy3 Val Thr Tyr Hi6 Asn Gly Thr
35 40 45
Gly Tyr Cys Lys Cys Pro Giu Gly Phe Leu Cly Clu Tyr Cys Gin His
SO 55 60
Arg Asp Pro Cys Giu Lys Asn Arg Cys Gin Asn Gly Gly Thr Cys Val
65 70 75 80
Ala Gin Ala Met Leu Cly Lys Ala Thr Cys Arg Cys Ala Ser cly Phe
85 90 95
Thr Gly Glu Asp Cy6 Gin Tyr Ser Thr Ser His Pro Cys Phe Val Ser
100 105 HO
Arg Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys His Met Leu Ser Arg Asp Thr
IIS 120 125
Tyr Clu Cys Thr Cys Gin Val Gly Phe Thr Cly Lys Clu Cys Gin Trp
130 135 140
Thr Asp Ala Cys Leu Ser His Pro Cys Ala Asn Gly Ser Thr Cys Thr
14S 150 155 160
Thr Val Ala Asn Gin Phe Ser Cys Lys Cys Leu Thr Cly Phe Thr Cly
165 170 175
Gin Lys Cys Clu Thr Asp Val Asn Clu Cys Asp lie Pro Cly His Cys
180 185 190
Gin His Gly Gly Thr Cys Leu Asn Leu pro Gly Ser Tyr Cln Cys Cln
195 200 205
Cys Pro Gin Gly Phe, Thr Cly Gin Tyr Cys Asp Ser Leu Tyr Val Pro
210 215 220
Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Gly Oly Thr Cys Arg Cln Thr Gly
225 230 235 240
Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly ser Thr
245 250 255
Cys Clu Arg Asn He Asp Asp Cys Pro Asn His Arg Cys Gin Asn Gly
260 265 270
Gly Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro
275 280 285
187
Cln Trp Thr Cly Cln Phe Cys Thr Clu Asp Val Asp Clu Cys Leu Leu
290 29S 300
Gin Pro Asn Ala Cys Gin Afln Gly Gly Thr Cys Ala Aan Arg Aan Cly
305 310 315 320
Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val Asn Cly Trp Ser Gly Aap Asp Cys Ser
325 330 335
Clu Asn He Asp Asp Cys Ala Phe Ala ser Cys Thr Pro Cly Ser Thr
340 345 350
Cys He Asp Arg Val Ala Ser Phe Ser Cys Met Cys Pro Clu Cly Lys
355 360 365
Ala Cly Leu Leu Cys His Leu Asp Asp Ala Cys He Ser Asn Pro Cys
370 375 380
His Lys Cly Ala Leu Cys Asp Thr Asn Pro Leu Asn Gly Cln Tyr He
365 390 39S 400
Cys Thr Cys Pro Cln Cly Tyr Lys Cly Ala Asp Cys Thr Clu Asp Val
405 410 415
Asp Clu Cys Ala Het Ala Asn Set Asn Pro Cys Clu His Ala Cly Lys
420 425 430
Cys val Asn Thr Asp Cly Ala Phe His Cys Clu Cys Leu Lys Cly Tyr
435 440 445
Ala Cly Pro Arg Cys Clu Met Asp He Asn Clu Cys His Ser Asp Pro
450 4SS 460
Cys Cln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Lys He Gly Cly Phe Thr Cys
465 470 475 460
Leu Cys Met Pro Cly Phe Lys Cly Val His Cys Clu Leu Clu.He Asn
48S 490 495
Clu Cys Cln Ser Asn Pro Cys Val Asn Asn Cly Cln Cys Val Asp Lys
500 SOS S10
Val Aan Arg Phe Gin Cys Leu Cys Pro Pro cly Phe Thr Gly Pro Val
SIS S20 S2S
Cys Gin He Asp He Asp Asp Cys Ser Ser Thr Pro Cys Leu Asn Cly
530 S3S 540
Ala Lys Cys Ile Asp His Pro Asn Gly Tyr Glu Cys Cln Cys Ala Thr
S45 SSO SS5 560
Cly Phe Thr Cly Val Leu Cys Clu Clu Asn He Asp Asn Cys Asp Pro
S6S 570 575
Asp Pro Cys His His Cly Gin Cys Cln Asp Gly He Asp Ser Tyr Thr
580 S8S S90
cys He Cys Asn Pro Cly Tyr Met Cly Ala He Cys ser Asp Gin He
S9S 600 ... 605
Asp Clu Cys Tyr Ser Ser Pro Cys Leu Asn Asp Cly Arg Cys He Asp
610 615 620
Leu Val Asn Oly Tyr Cln Cys Asn Cys Cln Pro Cly Thr Ser Gly Val
62S 630 635 640
Asn Cys Clu He Aan Phe Asp Asp Cys Ala Ser Asn Pro Cys He Hie
188
645
650
6SS
Cly He Cys Met Asp Cly He Asn Arg Tyr Ser Cys Val Cys Ser Pro
660 665 670
Cly Phe Thr Cly Cln Arg Cys Asn He Asp He Asp clu Cys Ala Ser
67S 680 685
Asn Pro Cys Arg Lys Cly Ala Thr Cys He Asn Cly Val Asn Cly Phe
690 695 700
Arg Cys He Cys Pro Clu Cly Pro His His Pro Ser Cys Tyr Ser Gin
70S 710 715 720
Val Asn Clu Cys Leu Ser Asn Pro Cys He His Cly Asn Cys Thr Cly
725 730 735
Cly Leu Ser Cly Tyr Lys Cys Leu Cys Asp Ala Cly Trp Val Cly He
740 745 7S0
Asn Cys Clu Val Asp Lys Asn Clu Cys Leu Ser A6n Pro Cys Gin Asn
755 760 76S
Gly Cly Thr Cys Asp Asn Leu val Asn Cly Tyr Arg Cys Thr Cys Lys
770 775 780
Lys Cly Phe Lys Cly Tyr Asn Cys Cln Val Asn He Asp clu Cys Ala
765 790 795 800
Ser Asn Pro Cys Leu Asn Cln Cly Thr Cys Phe Asp Asp He Ser Cly
80S 810 815
Tyr Thr Cys His Cys Val Leu Pro Tyr Thr Cly Lys Asn Cys Cln Thr
620 82S 830
Val Leu Ala Pro Cys Ser Pro Asn Pro Cys Clu Asn Ala Ala Val Cys
835 840 84S
Lys Clu Ser Pro Aan Phe Glu Ser Tyr Thr Cys Leu Cys Ala Pro Cly
650 8S5 860
Trp Gin Cly Cln Arg Cys Thr He Asp He Asp clu Cys He Ser Lye
865 870 87S 880
Pro Cys Met Asn His Cly Leu cys His Asn Thr Gin Cly Ser Tyr Met
885 890 895
Cys Clu Cys Pro Pro Cly Phe Ser Gly Met Asp Cys Glu clu Asp He
900 905 910
Asp Asp Cys Leu Ala Asn Pro Cys Gin Asn Cly Cly Ser Cys Met Asp
91S 920 925
Cly Val Asn Thr Phe ser Cys Leu Cys Leu Pro Cly Phe Thr Cly Asp
930 93S 940
Lys Cys Cln Thr Asp Met Asn Clu Cys Leu Ser Clu Pro Cys Lys Asn
945 950 9S5 960
Cly Cly Thr Cys Ser Asp Tyr Val Asn Ser Tyr Thr Cys Lys Cys Cln
965 970 975
Ala Gly Phe Asp Cly Val His Cys Clu Asn Asn He Asn Clu Cys Thr
980 985 990
Clu Ser Sex Cys Phe Asn Cly Gly Thr Cys Val Asp Cly He Asn Ser
995 1000 100S
189
Phe ser Cys Leu Cys Pro Val Cly Phe Thr cly Ser Phe Cys Leu His
1010 1015 1020
Clu Ile Asn Clu Cys Ser Ser His Pro Cys Leu Asn Glu Gly Thr Cys
1025 1030 1035 1040
val Asp Gly Leu Gly Thr Tyr Arg Cys Ser Cys Pro Leu cly Tyr Thr
1045 1050 1055
Cly Lys Asn Cys Cln Thr Leu Val Asn Leu Cys Ser Arg Ser Pro Cys
1060 1065 1070
Lys Asn Lys Gly Thr Cys Val Gin Lys Lys Ala Glu Ser Gin Cys Leu
1075 1080 lOflS
Cys Pro ser Cly Trp Ala Cly Ala Tyr Cys Asp Val Pro Asn Val Ser
1090 1095 1100
Cys Asp He Ala Ala Ser Arg Arg Cly Val Leu Val Clu His Leu Cys
1105 1110 HIS 1120
Gin His Ser Gly Val Cys He Asn Ala Cly Asn Thr Hls Tyr Cys Gin
1125 1130 113S
Cys Pro Leu Cly Tyr Thr cly Ser Tyr Cys Clu Clu Gin Leu Asp Clu
1140 1145 11S0
Cys Ala Ser Asn Pro cys Cln His Cly Ala Thr Cys Ser Asp Phe He
1155 1160 116S
Gly Gly Tyr Arg Cys Clu Cys Val Pro Gly Tyr Cln Cly Val Asn Cys
1170 1175 1180
Clu Tyr Glu Val Asp Clu cys cln Aan Gin Pro Cys Gin Asn Gly Cly
1185 1190 1195 1200
Thr Cys He Aap Leu val Asn Hls Phe Lys Cys Ser Cys Pro Pro Gly
1205 1210 1215
Thr Arg Gly Leu Leu Cys Clu Clu Asn He Asp Asp Cys Ala Arg Gly
1220 1225 1230
Pro Hls Cys Leu Asn Cly Cly Cln Cys Met Asp Arg He Cly Cly Tyr
1235 1240 124S
Ser Cys Arg Cys Leu Pro Cly Phe Ala Cly Clu Arg Cys Clu Cly Asp
12S0 12SS 1260
He Asn Clu Cya Leu Ser Asn Pro Cys Ser Ser Clu Oly Ser Leu Asp
126S 1270 127S 1280
Cys He Gin Leu Thr Asn Asp Tyr Leu Cys val Cys Arg Ser Ala Phe
1285 1290 1295
Thr Oly Arg His Cys Clu Thr Phe Val Asp Val Cys Pro Gin Met Pro
1300 130S 1310
Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ala Val Ala Ser Asn Met Pro Asp Gly
131S 1320 132S
Phe He Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe Ser cly Ala Arg Cys Gin Ser
1330 1335 1340
Ser Cys Gly Gin Val Lys Cys Arg Lys Oly clu Cln Cys Val Hls Thr
1345 1350 1355 1360
Ala Ser Cly Pro Arg Cys Phe Cys Pro Ser Pro Arg Asp cys Glu Ser
190
136S 1370 1375
Cly Cys Ala Ser Ser Pro Cys Cln His Cly Cly Ser Cys His Pro Cln
1380 1385 1390
Arg Cln Pro Pro Tyr Tyr Ser Cys Cln Cys Ala Pro Pro Phe Ser Cly
1395 1400 1405
Ser Arg Cys Clu Leu Tyr Thr Ala Pro Pro Ser Thr Pro Pro Ala Thr
1410 1415 1420
Cys Leu Ser Cln Tyr Cys Ala Asp Lys Ala Arg Asp Cly Val Cys Asp
1425 1430 143S 1440
Clu Ala Cys Asn Ser His Ala Cys Gin Trp Asp Cly Cly Asp Cys Ser
1445 1450 14SS
Leu Thr Met Clu Asn Pro Trp Ala Asn cys Ser ser Pro Leu Pro Cys
1460 1465 1470
Trp Asp Tyr He Asn Asn Cln Cys Asp Clu Leu Cys Asn Thr Val Clu
147S 1480 148S
Cys Leu Phe Asp Asn Phe Clu Cys Cln Cly Asn Ser Lys Thr Cys Lys
1490 1495 1SO0
Tyr Asp Lys Tyr Cys Ala Asp His Phe Lys Asp Asn His Cys Asn Cln
1S0S 1510 ISIS 1520
Gly Cys Asn Ser Clu Clu Cys Gly Trp Asp Cly Leu Asp Cys Ala Ala
1525 1530 1535
Asp Cln Pro Clu Asn Leu Ala Glu Cly Thr Leu val He Val val Leu
1540 1S45 15S0
Met Pro Pro Clu Cln Leu Leu Gin Asp Ala Arg Ser Phe Leu Arg Ala
1S5S 1560 1S6S
Leu Cly Thr Leu Leu His Thr Asn Leu Arg He Lys Arg Asp Ser Cln
1S70 1S7S 1S80
Cly Clu Leu Met Val Tyr Pro Tyr Tyr Cly Clu Lys Ser Ala Ala Met
1585 1S90 1595 1600
Lys Lyo Cln Arg Met Thr Arg Arg Ser Leu Pro Cly Clu Cln Clu Cln
160S 1610 1615
Clu Val Ala Gly Ser Lys Val Phe Leu clu He Asp Asn Arg cln Cys
1620 1625 1630
Val Cln Asp Ser Asp His cys Phe Lys Asn Thr Asp Ala Ala Ala Ala
163S 1640 1S4S
Leu Leu Ala Ser His Ala He Cln Cly Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Val
16S0 1655 1660
Ser Val Val Ser Clu Ser Leu Thr Pro Clu Arg Thr Cln Leu Leu Tyr
166S 1670 167S 1680
Leu Leu Ala Val Ala Val Val He He Leu Phe He He Leu Leu Gly
1685 1690 1695
Val He Het Ala Lys Arg Lys Arg Lys Hls Cly Ser Leu Trp Leu Pro
1700 1705 1710
Glu Cly Phe Thr Leu Arg Arg Asp Ala Ser Asn His Lys Arg Arg Glu
171S 1720 1725
191
Pro Val Cly Cln Asp Ala Val Cly Leu Lys Asn Leu Ser Val Cln Val
1730 1735 1740
Ser Clu Ala Asn Leu He Cly Thr Cly Thr Ser Clu Hi3 Trp Val Asp
1745 1750 1755 1760
Asp Clu Gly Pro Cln Pro Lys Lys Val Lys Ala Clu Asp Glu Ala Leu
176S 1770 1775
Leu Ser Clu Clu Asp Asp Pro He Asp Arg Arg pro Trp Thr Cln Cln
1780 1785 1790
His Leu Clu Ala Ala A6p He Arg Arg Thr Pro Ser Leu Ala Leu Thr
179S 1800 1805
Pro Pro Cln Ala Clu Gin Glu Val Asp Val Leu Asp Val Asn Val Arg
1610 IBIS 1620
Cly Pro Asp Gly Cys Thr Pro Leu Met Leu Ala Ser Leu Arg cly Gly
1825 1830 1835 1840
Ser Ser Asp Leu Ser Asp Glu Asp Clu Asp Ala Clu Asp Ser Ser Ala
1845 1850 1855
Asn He He Thr Asp Leu Val Tyr cln Cly Ala Ser Leu ein Ala Cln
1860 1865 1870
Thr Asp Arg Thr Cly Clu Met Ala Leu Kis Leu Ala Ala Arg Tyr Ser
1875 1880 .1885
Arg Ala Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Asp Ala Cly Ala Asp Ala Asn
1890 1895 1900
Ala Cln Asp Asn Met Cly Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala
1905 1910 1915 1920
Asp Ala cln Cly Val phe cln He Leu He Arg Asn Arg Val Thr Asp
1925 1930 1935
Leu Asp Ala Arg Met Asn Asp Cly Thr Thr Pro Leu He Leu Ala Ala
1940 194S 1950
Arg Leu Ala val Glu Gly Met val Ala clu Leu He Asn eye ein Ala
19SS 1960 1965
Asp Val Asn Ala Val Asp Asp His Cly Lys ser Ala Leu His Trp Ala
1970 1975 1980
Ala Ala Val Asn Asn Val Clu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Lys Aan Cly
198S 1990 1995 2000
Ala Asn Arg Asp Met Cln Asp Asn Lys Clu clu Thr Pro Leu Phe Leu
2005 2010 201S
Ala Ala Arg Clu Gly Ser Tyr Clu Ala Ala Lys He Leu Leu Asp His
2020 202S 2030
Phe Ala Asn Arg Asp He Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp
203S 2040 204S
Val Ala Arg Asp Arg Met His His Asp He Val Arg Leu Leu Aop Clu
20S0 20SS 2060
Tyr Asn Val Thr Pro Ser Pro Pro Cly Thr val Leu Thr Ser Ala Leu
2065 2070 207S 2080
Ser Pro Val He Cys Cly Pro Asn Arg Ser Phe Leu Set Leu Lys His
192
2085 2090 209S
Thr Pro Met Cly Lys Lys Ser Arg Arg Pro Ser Ala Lys Ser Thr Het
2100 2105 2110
Pro Thr Ser Leu Pro Asn Leu Ala Lys Clu Ala Lys Asp Ala Lys Cly
2115 2120 212S
Ser Arg Arg Lys Lys Ser Leu Ser Clu Lys Val Cln Leu Ser Clu ser
2130 2135 2140
Ser Val Thr Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Clu Ser Pro His Thr Tyr
2145 2150 215S 2160
Val Ser Asp Thr Thr Ser Ser Pro Met Ile Thr Ser Pro Gly He Leu
2165 2170 2175
Cln Ala Ser Pro Asn Pro Met Leu Ala Thr Ala Ala Pro Pro Ala Pro
2180 2185 2190
Val His Ala Cln His Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu His Clu Met Gin
2195 2200 2205
Pro Leu Ala His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser Cln Leu
2210 221S 2220
Leu Ser His His His He Val ser Pro Gly Ser Gly Ser Ala Cly Ser
222S 2230 2235 2240
Leu Ser Arg Leu His Pro Val Pro val Pro Ala.Asp Trp Met Asn Arg
2245 2250 2255
Met Glu Val Asn Glu Thr Gin Tyr Asn Clu Met Phe Cly Met Val Leu
2260 226S 2270
Ala Pro Ala Clu Gly Thr His Pro Gly He Ala Pro ein Ser Arg Pro
2275 2280 2285
Pro Clu Cly Lys His He Thr Thr pro Arg Clu Pro Leu Pro Pro He
2290 2295 2300
Val Thr Phe Cln Leu Ho Pro Lys Cly Ser He Ala Cln Pro Ala Cly
230S 2310 2315 2320
Ala Pro Cln Pro Cln Ser Thr Cys Pro Pro Ala Val Ala Gly Pro Leu
232S 2330 2335
Pro Thr Met Tyr Oln He Pro Glu Met Ala Arg Leu Pro Ser Val Ala
2340 2345 2350
Phe Pro Thr Ala Met Met Pro Gin Gin Asp Gly Gin Val Ala Gin Thr
235S 2360 2365
He Leu Pro Ala Tyr His Pro Phe Pro Ala Ser Val Gly Lys Tyr Pro
2370 2375 2380
Thr Pro Pro Sex Gin His Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Ala Ala Clu Arg
2385 2390 2395 2400
Thr Pro Ser His Ser Gly His Leu Cln Gly Glu His Pro Tyr Leu Thr
2405 2410 241S
Pro Ser Pro Clu Ser Pro Asp Gin Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser
2420 242S 2430
Ala Ser Asp Trp Ser Asp Val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Gly Gly Ala
243S 2440 2445
193
Gly Cly Gly Gin Arg Gly Pro Gly Thr His Met Ser Clu Pro Pro His
2450 2455 2460
Asn Asn Met Gin Val Tyr Ala
2465 2470
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 20 :
5
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE :
(A) LONGUEUR : 2556 acides aminés
(B) TYPE : acide aminé
(C) TYPE DE BRIN : simple
10 (D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 20
15
194
Met pro Pro Leu Leu Ala Pro Leu Leu Cys Leu Ala Leu Leu Pro Ala
15 10 15
Leu Ala Ala Arg Gly Pro Arg Cys Ser Gin Pro Gly Clu Thr Cys Leu
20 25 30
Asn Cly Cly Lye Cys Clu Ala Ala Asn Gly Thr Glu Ala Cys Val Cys
35 40 45
Gly Gly Ala Phe Val Gly Pro Arg Cys Cln Asp Pro Asn Pro Cys Leu
50 55 60
Ser Thr Pro Cys Lys Asn Ala Gly Thr Cys His Val Val Asp Arg Arg
65 70 75 80
Gly Val Ala Asp Tyr Ala Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Ser Gly Pro
85 90 95
Leu Cys Leu Thr Pro Leu Asp Asn Ala Cys Leu Thr Asn Pro Cys Arg
100 105 110
Asn Gly Gly Thr Cys Asp Leu Leu Thr Leu Thr Glu Tyr Lys Cys Arg
115 120 12S
Cys Pro Pro Gly Trp Ser Gly Lys Ser Cys Gin Gin Ala Asp Pro Cys
130 135 140
Ala Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Cly Gin Cys Leu pro Phe Clu Ala
145 150 155 160
Ser Tyr He Cys His Cys Pro Pro Ser Phe His Gly Pro Thr Cys Arg
165 170 175
Gin Asp Val Asn Glu Cys Gly Gin Lys Pro Arg Leu Cys Arg His Gly
160 18S 190
Gly Thr Cys His Asn Glu Val Gly Ser Tyr Arg Cys Val Cys Arg Ala
195 200 205
Thr Hia Thr Gly Pro Asn Cys Giu Arg Pro Tyr Val Pro Cys Ser Pro
210 215 220
ser Pro Cys Gin Asn Gly Cly Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asp Val Thr
225 230 235 240
Hit Glu Cys Ala Cys Leu Pro Gly Phe Thr Cly Gin Asn Cys Clu Glu
245 250 255
195
Asn He Asp Asp Cya Pro Cly Asn Asn Cys Lys Asn Cly Cly Ala Cys
260 265 270
Val Asp Cly Val Asn Thr Tyr Asn Cy6 Pro Cys Pro Pro Clu Trp Thr
275 280 285
Cly Cln Tyr Cys Thr Clu Asp val Asp clu Cys Cln Leu Met Pro Asn
290 295 300
Ala Cys Gin Asn Oly Cly Thr Cys His Asn Thr His Gly Gly Tyr Asn
305 310 315 320
Cys Val Cys Val Asn Cly Trp Thr Cly clu Asp Cys Ser Glu Asn He
325 330 335
Asp Asp Cys Ala Ser Ala Ala Cys Phe His Cly Ala Thr Cys His Asp
340 345 3S0
Arg Val Ala Ser Phe Tyr cys clu cys Pro His cly Arg Thr Cly Leu
355 360 365
Leu Cys His Leu A6n Asp Ala Cys He Ser Asn Pro Cys Asn Clu Cly
370 375 380
Ser Asn Cys Asp Thr Asn Pro Val Asn Cly Lys Ala He Cys Thr Cys
385 390 395 400
Pro Ser Gly Tyr Thr Cly Pro Ala Cys Ser Gin Asp Val Asp Clu Cys
40S 410 415
Ser Leu Cly Ala Asn Pro Cys clu His Ala Gly Lys Cys He Asn Thr
420 42S 430
Leu Cly Ser Phe Clu Cys Cln Cys Leu cln Cly Tyr Thr Gly Pro Arg
435 440 44S
Cys Glu He Asp Val Asn Glu Cys Val Ser Asn Pro Cys Cln Asn Asp
4S0 455 460
Ala Thr Cys Leu Asp Gin He Cly Clu Phe Cln Cys Met Cys Met Pro
465 470 475 480
Gly Tyr Clu cly Val His Cys Clu Val Asn Thr Asp Clu Cys Ala Ser
485 490 495
Ser Pro Cys Leu His Asn Cly Arg Cys Leu Asp Lys He Asn Glu Phe
S00 505 S10
Cln Cys Clu Cys Pro Thr Gly Phe Thr Cly Mis Leu Cys cln Tyr Asp
515 520 $25
Val Asp Clu Cys Ala Ser Thr Pro Cys Lys Asn Cly Ala Lys cys Leu
S30 S3S 540
Asp Cly Pro Asn Thr Tyr Thr Cys Val Cys Thr Clu Cly Tyr Thr Cly
S4S SSO 5SS 560
Thr His Cys Clu val Asp He Asp Clu cys Asp Pro Asp Pro cys His
56S S70 S7S
Tyr Gly Ser Cys Lys Asp Gly Val Ala Thr Phe Thr cys Leu Cys Arg
580 585 S90
Pro Gly Tyr Thr Cly His His Cys Clu Thr Asn He Asn Clu Cys Ser
595 600 605
Ser Cln Pro Cys Arg Leu Arg Cly Thr Cys Cln Asp Pro Asp Asn Ala
196
610
61S
620
Tyr Leu Cys Phe Cys Leu Lys Cly Thr Thr Gly Pro Asn Cys Clu He
625 630 635 640
Asn Leu Asp Asp Cys Ala Ser Ser Pro Cys Asp Ser Cly Thr Cys Leu
645 650 6SS
Asp Lys He Asp Cly Tyr Clu Cys Ala Cys Clu Pro cly Tyr Thr Gly
660 665 670
Ser Het Cys Asn Ser Asn He Asp Clu Cys Ala Cly Asn Pro Cys His
67S 660 685
Asn Cly Cly Thr Cys Clu Asp Cly Ile Asn Cly Phe Thr Cys Arg Cys
690 695 700
Pro Glu Cly Tyr His Asp Pro Thr Cys Leu Ser clu val Asn Glu Cys
705 710 715 720
Asn Ser Asn Pro Cys Val His Cly Ala Cys Arg Asp Ser Leu Asn Cly
72S 730 735
Tyr Lys Cys Asp Cys Asp Pro Oly Trp Ser Oly Thr Asn Cys Asp Ile
740 745 750
Asn Asn Asn clu Cys Glu Ser Asn Pro Cys Val Asn Gly Cly Thr Cys
755 760 76S
. Lys Asp Met Thr Ser Cly Ile Val cys Thr Cya Arg Clu cly Phe Ser
770 775 780
Gly Pro Aan Cys Cln Thr Asn Ile Asn Clu Cys Ala Ser Asn Pro Cys
785 790 795 800
Leu Asn Lys Gly Thr Cys Ile Asp Asp Val Ala Cly Tyr Lys Cys Asn
60S 810 .815
Cys Leu Leu Pro Tyr Thr Cly Ala Thr Cys Clu Val Val Leu Ala Pro
620 825 830
Cys Ala Pro Ser Pro Cys Arg Asn Cly Cly Glu Cys Arg Cln Ser Clu
835 840 845
Asp Tyr Clu Ser Pho ser Cys Val Cys Pro Thr Ala Gly Ala Lys Cly
850 855 860
Cln Thr Cys Clu Val Asp He Asn Clu Cys Val Leu Ser Pro Cys Arg
865 870 675 880
His Cly Ala Ser Cys Cln Asn Thr His Gly Cly Tyr Arg Cys His Cys
885 890 895
Cln Ala Cly Tyr Ser Gly Arg Asn Cys Clu Thr Abp He Asp Asp Cys
900 90S 910
Arg Pro Asn Pro Cys His Asn Gly Cly Ser Cys Thr Asp Cly He Asn
915 920 92S
Thr Ala Phe Cys Asp Cys Leu Pro Cly Phe Arg Gly Thr Phe Cys clu
930 93S 940
Clu Asp He Asn clu Cys Ala Ser Asp Pro Cys Arg Asn Cly Ala Asn
945 950 955 960
Cys Thr Asp Cys Val Asp Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Pro Ala Cly Phe
96S 970 97S
197
Ser Cly He His Cys Clu Asn Asn Thr Pro Asp Cys Thr Clu Ser Ser
980 98S 990
Cys Phe Asn Cly Gly Thr Cys Val Asp Gly He Asn Ser Phe Thr Cys
995 1000 1005
Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Cly Ser Tyr Cys Cln His Val Val Asn
1010 101S 1020
Clu Cys Asp Sec Arg Pro Cys Leu Leu Cly Cly Thr Cya Cln Asp Cly
1025 1030 1035 1040
Arg Cly Leu His Arg Cys Thr Cys Pro Cln Cly Tyr Thr Cly Pro Asn
1045 1050 1055
Cys Cln Asn Leu Val Hls Trp Cys Asp Ser Ser Pro Cys Lys Asn Cly
1060 1065 1070
Cly Lyo Cys Trp Cln Thr His Thr Cln Tyr Arg Cys Clu Cys Pro Ser
107S 1080 1085
Cly Trp Thr Gly Leu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Val Ser Cy6 Glu Val
1090 1095 1100
Ala Ala Cln Arg Cln Cly Val Asp Val Ala Arg Leu Cys Cln His Gly
HOS 1110 1115 1120
Cly Leu cys Val Asp Ala Gly Asn Thr Hls Hls Cys Arg Cys Gin Ala
1125 1130 1135
Gly Tyr Thr cly Ser Tyr Cys Clu Asp Leu Val Asp Glu Cys Ser Pro
1140 1145 11S0
Ser Pro Cys Cln Asn Gly Ala Thr Cys Thr Asp Tyr Leu Cly Cly Tyr
11SS 1160 1165
Ser Cys Lys Cys Val Ala Cly Tyr Hls Cly Val Asn Cys Ser Clu Clu
1170 '? 1175 1180
He Asp Clu Cys Leu Ser Hls Pro Cys Cln Asn Cly Cly Thr Cys Leu
1165 1190 1195 1200
Asp Leu Pro Asn Thr Tyr Lys Cys Ser Cys Pro Arg Cly Thr Gin Cly
1205 1210 1215
Val His Cys Glu He Asn Val Asp Aap Cys Asn Pro Pro Val Asp Pro
1220 1225 1230
Val Ser Arg Ser Pro Lys Cys Phe Asn Asn Cly Thr Cys Val Asp Cln
1235 1240 1245
Val Cly Gly Tyr Ser Cys Thr Cys Pro Pro Cly Phe Val ciy Clu Arg
12S0 1255 1260
Cys Clu Cly Asp val Asn Clu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Asp Ala Arg
1265 1270 127S 1280
Gly Thr Cln Asn Cys Val Cln Arg Val Asn Asp Phe His Cya Clu Cys
1285 1290 129S
Arg Ala Cly His Thr Cly Arg Arg Cys Glu Ser Val He Asn Gly Cys
1300 1305 1310
Lys Cly Lys Pro Cys Lys Asn Cly Cly Thr Cys Ala Val Ala Ser Aan
1315 1320 1325
Thr Ala Arg Cly Phe He Cys Lys Cys Pro Ala Gly Phe Clu Oly Ala
198
1330 1335 1340
Thr Cys Glu Asn Asp Ala Arg Thr Cys cly Ser Leu Arg Cys Leu Asn
1345 1350 135S 1360
Cly Gly Thr Cys He Ser Cly Pro Arg Ser Pro Thr Cys Leu Cys Leu
1365 1370 1375
Gly Pro Phe Thr Gly Pro Clu Cys Gin Phe Pro Ala Ser Ser Pro Cys
1380 1385 1390
Leu Gly Cly Asn Pro Cys Tyr Asn Cln Cly Thr Cys Glu Pro Thr Ser
1395 1400 140S
Glu Ser Pro Phe Tyr Arg Cys Leu Cys Pro Ala Lys Phe Asn Gly Leu
1410 1415 1420
Leu Cys His He Leu Asp Tyr Ser Phe Cly Cly Gly Ala Gly Arg Aap
142S 1430 143S 1440
He Pro Pro Pro Leu He Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Cln
144S 1450 14SS
Glu Asp Ala Gly Asn Lys Val Cys Ser Leu Cln Cys Asn Asn His Ala
1460 146S 1470
Cys Gly Trp Asp cly Cly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp
147S 1480 1485
Lys Asn Cys Thr Cln Ser Leu Cln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly
1490 1495 1500
His Cys Asp Ser Cln Cys Asn Ser Ala Gly Cy6 Leu Phe Asp Gly Phe
1505 1510 1515 1S20
Asp Cya Gin Arg Ala Glu Gly Gin Cys Asn Pro Leu Tyr Aap Gin Tyr
1S2S 1530 1535
Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Cly His Cys Asp Gin Cly Cys Asn Ser
1S40 1S45 1SS0
Ala Glu Cys Clu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Clu His val Pro Clu
1555 1560 1565
Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Val Val val Leu Met Pro Pro Glu
1570 1575 1580
Gin Leu Arg Asn Ser Ser Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser Arg Val
1585 1590 1S9S 1600
Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg Asp Ala His Gly Gin Gin Met
1605 1610 1615
He Phe Pro Tyr Tyr Gly Arg Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro He
1620 1625 1630
Lys Arg Ala Ala Glu Cly Trp Ala Ala Pro Asp Ala Leu Leu Cly Gin
163S 1640 1645
Val Lys Ala Ser Leu Leu Pro Cly Cly Ser Clu Cly Cly Arg Arg Arg
1650 1655 1660
Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp Val Arg Cly Ser He Val Tyr Leu Clu
1665 1670 1675 1680
He Asp Asn Arg cln Cys Val Cln Ala Ser Ser Cln Cys Phe Cln Ser
1685 1690 1695
199
Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu cly Ala Leu Ala Ser Leu Cly Ser
1700 1705 1710
Leu Asn He Pro Tyr Lys He Clu Ala Val cln Ser Glu Thr Val Clu
1715 1720 1725
Pro Pro Pro Pro Ala Cln Leu His Phe Met Tyr Val Ala Ala Ala Ala
1730 1735 1740
Phe val Leu Leu Phe Phe Val Cly Cys Cly Val Leu Leu Ser Arg Lys
1745 1750 175S 1760
Arg Arg Arg Gin His Cly Cln Leu Trp Phe Pro Clu Cly Phe Lys Val
176S 1770 177S
Ser 'Clu Ala ser Lys Lys Lys Arg Arg Clu Clu Leu Cly Clu Asp Ser
1780 1785 1790
Val Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp
1795 1800 1805
Asp Asn Gin Asn Glu Trp Cly Asp Clu Asp Leu Clu Thr Lys Lys Phe
1810 1815 1820
Arg Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro Asp Leu Asp Asp Gin Thr Asp
1825 1830 1835 1640
His Arg Gin Trp Thr Cln Cln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Het
1845 1850 18SS
Ser Ala Met Ala Pro Thr Pro Pro Gin Gly Clu Val Asp Ala Asp Cys
1860 186S 1870
Met Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met He
1875 1880 188S
Ala Ser Cys ser Cly Gly Cly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Clu Glu
1890 189S 1900
Clu Asp Ala Pro Ala Val He ser Asp Phe He Tyr Cln Gly Ala Ser
1905 1910 1915 1920
Lou His Asn Cln Thr Asp Arg Thr Cly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala
1925 1930 1935
Ala Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Clu Ala Ser
1940 1945 19S0
Ala Asp Ala Asn He Cln Asp Asn Met cly Arg Thr Pro Leu His Ala
19SS I960 1965
Ala Val Ser Ala Asp Ala Gin Cly Val Phe Cln He Leu He Arg Asn
1970 197S 1980
Arg Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp Cly Thr Thr Pro Leu
198S 1990 1995 2000
He Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Clu Cly Met Leu Clu Asp Leu He
200S 2010 2015
Asn Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu Cly Lys Ser Ala
2020 2025 2030
Leu His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu
2035 2040 204S
Leu Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Cln Asn Asn Arg clu Clu Thr
200
20S0 205S 2060
Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Clu Gly Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val
2065 2070 2075 2080
Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp He Thr Asp His Met Asp Arg
2085 2090 2095
Leu Pro Arg Asp He Ala Gin Clu Arg Met His His Asp He Val Arg
2100 210S 2110
Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gin Leu His Cly Ala
2115 2120 2125
Pro Leu Gly Cly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser Pro Asn
2130 213S 2140
Gly Tyr Leu Cly Ser Leu Lys Pro Cly Val Cln Cly Lys Lys Val Arg
2145 21S0 215S 2160
Lys Pro Ser Ser Lys Cly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala Lys Asp
216S 2170 2175
Leu Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gin Asp Gly Lys Cly Cys Leu Leu
2180 2185 2190
Asp Ser Ser Cly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Clu Ser Pro His
2195 2200 220S
Cly Tyr Leu Sar Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu Pro Ser Pro Phe
2210 2215 2220
Gin Cln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro Gly Met Pro Asp
2225 2230 2235 2240
Thr His Leu Gly He Gly His Leu Asn Val Ala Ala Lys Pro Clu Met
2245 22S0 2255
Ala Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ala Phe Glu Thr Gly Pro Pro
2260 2265 2270
Arg Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Cly Thr ser Thr Val Leu cly
2275 2280 2285
Ser Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr Val Gly Cly Ser Thr Ser
2290 2295 2300
Leu Asn' Gly Gin Cys Glu Trp Leu 5er Arg Leu Cln Ser Gly Met Val
230S 2310 2315 2320
Pro Asn Cln Tyr Asn Pro Leu Arg Gly Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu
2325 2330 2335
Ser Thr Cln Ala Pro Ser Leu Cln His Cly Met Val Gly Pro Leu His
2340 2345 2350
ser Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ser Gin Met Met Ser Tyr Gin Gly
2355 2360 2365
Leu Pro ser Thr Arg Leu Ala Thr Gin Pro His Leu Val Gin Thr Gin
2370 2375 2380
Cln Val Cln Pro Cln Asn Leu ein Met Gin Cln Gin Asn Leu Cln Pro
2385 2390 2395 2400
Ala Asn He Gin Gin Cln Cln Ser Leu Cln Pro Pro Pro Pro Pro Pro
2405 2410 2415
201
10
Cln Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu Gly Arg
2420 2425 2430
Ser Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gin Ala Asp Val Gin Pro Leu Gly
2435 2440 2445
Pro Ser Ser Leu Ala Val His Thr He Leu Pro Gin Glu Ser Pro Ala
2450 2455 2460
Leu Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro Val Thr Ala Ala
2465 2470 2475 2480
Cln Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gin His Ser Tyr Ser Ser Pro Val Clu
2485 2490 2495
Asn Thr Pro Set His cln Leu Cln Val Pro Glu His Pro Phe Leu Thr
2500 2505 2510
Pro Ser Pro Glu Ser Pro Asp Cln Trp ser Ser ser Ser Pro His Ser
2S1S 2520 2S2S
Asn Val Ser Asp Trp Ser Clu Cly Val Ser Ser Pro Pro Thr Ser Met
2530 2535 2540
Cln Ser Gin He Ala Arg He Pro Clu Ala Phe Lys
2545 2550 2555
(2) INFORMATIONS SUR SEQ ID N° : 21
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE
(A) LONGUEUR : 9723 paires de bases
(B) TYPE : acide nucléique
(C) TYPE DE BRIN : double
(D) TOPOLOGIE : inconnue
(ii) TYPE DE MOLECULE : ADNc
(ix) CARACTERISTIQUE :
(A) NOM/CLE : CDS
15 (B) EMPLACEMENT : 10...7419
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE : SEQ ID N° 21
202
GCAATTCCC CCC CCC CTC CGC CCC CCT CTC CTC TCG GCC CTC CTC GCC 48
Pro Ala Leu Arg Pro Ala Leu Leu Trp Ala Leu Leu Ala
IS 10
CTC TCG CTG TCC TCC CCC CCC CCC CCC CAT CCA TTC CAC TCT CGA CAT 96
Leu Trp Leu Cys Cys Ala Ala Pro Ala His Ala Leu Cln Cys Arg Asp
IS 20 25
CGC TAT CAA CCC TCT CTA AAT CAA CCA ATC TCT GTT ACC TAC CAC AAT 144
Cly Tyr Clu Pro Cys Val Aan Glu Cly Het Cys Val Thr Tyr His Asn
30 35 40 45
CCC ACA CGA TAC TCC AAA TCT CCA CAA CGC TTC TTC GCG CAA TAT TCT 192
Cly Thr Cly Tyr Cys Lys Cys Pro Clu Cly Phe Leu Cly Clu Tyr Cya.
SO SS 60
CAA CAT CCA CAC CCC TCT CAC AAG AAC CCC TGC CAC AAT CCT CCC ACT 240
Cln His Arg Asp Pro Cys Clu Lys Asn Arg Cya Gin Asn cly Cly Thr
65 70 75
TCT CTC CCC CAC GCC ATC CTC CGC AAA CCC ACC TCC CCA TCT CCC TCA 286
Cys Val Ala Cln Ala Met Leu Cly Lys Ala Thr Cya Arg Cys Ala Ser
203
80 8S 90
GGC TTT ACA CGA CAG CAC TCC CAC TAC TCA ACA TCT CAT CCA TCC TTT 336
Cly Phe Thr Cly Clu Asp Cys Cln Tyr Ser Thr See His Pro Cys Phe
9S 100 10S
CTC TCT CGA CCC TGC CTC AAT CGC CCC ACA TGC CAT ATC CTC ACC CCC 364
Val Ser Arg Pro Cya Leu Asn Cly Cly Thr Cys His Met Leu Ser Arg
110 115 120 12S
CAT ACC TAT CAC TCC ACC TCT CAA CTC CCG TTT ACA CGT AAC CAC TGC 432
Asp Thr Tyr Glu Cys Thr Cys Gin Val Cly Phe Thr Cly Lys Clu Cys
130 13S 140
CAA TCC ACC CAT CCC TCC CTC TCT CAT CCC TCT CCA AAT CCA ACT ACC 480
Cln Trp Thr Asp Ala Cys Leu Ser His Pro Cys Ala Asn Cly Ser Thr
145 150 155
TCT ACC ACT CTC CCC AAC CAG TTC TCC TCC AAA TCC CTC ACA GCC TTC 528
Cys Thr Thr Val Ala Asn Gin Phe Ser Cys Lys Cys Leu Thr Cly Phe
160 16S 170
ACA CCG CAC AAA TCT CAC ACT CAT CTC AAT GAC TCT GAC ATT CCA CCA 576
Thr Cly Cln Lys Cys Clu Thr Aap Val Asn Glu Cya Asp He Pro Cly
175 180 18S
CAC TGC CAC CAT CGT CCC ACC TGC CTC AAC CTC CCT GCT TCC TAC CAG 624
His Cys Cln His Cly Cly Thr Cys Leu Asn Leu Pro Cly Ser Tyr Cln
190 195 200 205
TCC CAG TCC CCT CAC CCC TTC ACA CCC CAC TAC TCT CAC ACC CTC TAT 672
Cys Cln Cys Pro Cln cly Phe Thr Gly ein Tyr Cys Asp Ser Leu Tyr
210 2IS 220
CTC CCC TCT CCA CCC TCA CCT TCT CTC AAT CCA CGC ACC TGT CCG CAC 720
Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Oly Gly Thr Cys Arg Gin
22S 230 235
ACT CCT CAC TTC ACT TTT CAC TCC AAC TCC CTT CCA CGT TTT CAA CCC 768
Thr Cly Asp Phe Thr Phe Clu Cys Asn Cys Leu Pro Cly Phe Clu oly
240 24S 250
ACC ACC TGT CAC ACC AAT ATT GAT CAC TCC CCT AAC CAC ACC TCT CAC 816
Ser Thr Cys Clu Arg Asn Ile Asp Aap Cys Pro Aan His Arg Cys ein
255 260 265
AAT CGA CGC CTT TOT CTG CAT CCC CTC AAC ACT TAC AAC TCC CGC TCT 864
Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Cly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg cys
270 27S 280 285
CCC CCA CAA TCG ACA CGA CAC TTC TCC ACA CAC CAT GTC GAT CAA TCC 912
Pro Pro Gin Trp Thr Cly Gin Phe Cys Thr Clu Aap Val Asp Glu Cys
290 295 300
CTG CTC CAO CCC AAT CCC TGT CAA AAT CCG CCC ACC TCT CCC AAC CCC 960
Leu Leu Cln Pro Asn Ala Cys Cln Asn Cly Cly Thr Cys Ala Asn Arg
30S 310 315
AAT CCA CCC TAT CGC TCT CTA TCT CTC AAC CGC TCG ACT CGA GAT GAC 1008
Asn Cly Cly Tyr Cly Cys Val cya Val Asn Cly Trp Ser Cly Asp Aap
320 325 330
TCC ACT CAG AAC ATT CAT CAT TCT CCC TTC CCC TCC TCT ACT CCA CGC 1056
Cys Ser Clu Asn He Asp Asp Cys Ala Phe Ala Ser Cys Thr Pro cly
33S 340 34S
TCC ACC TCC ATC CAC CCT CTC CCC TCC TTC TCT TCC ATC TCC CCA CAC 1104
204
Ser Thr Cys He Asp Arg Val Ala Ser Phe Ser Cys Met Cys Pro Clu
3S0 3S5 360 365
CGC AAC CCA CCT CTC CTG TCT CAT CTC CAT GAT CCA TGC ATC AGC AAT 1152
Gly Lys Ala Gly Leu Leu Cys Hls Leu Asp Asp Ala Cys He Ser Asn
370 375 380
CCT TCC CAC AAG GGG CCA CTC TCT CAC ACC AAC CCC CTA AAT CCC CAA 1200
Pro Cys His Lys Cly Ala Leu Cys Asp Thr Asn Pro Leu Asn Cly Gin
385 390 39S
TAT ATT TCC ACC TGC CCA CAA GGC TAC AAA GGC GCT GAC TCC ACA CAA 1248
Tyr He Cya Thr Cys Pro Cln Cly Tyr Lys Gly Ala Asp Cys Thr Clu
400 405 410
CAT CTG CAT CAA TCT GCC ATC CCC AAT AGC AAT CCT TCT GAG CAT CCA 1296
Asp Val Asp Clu Cys Ala Met Ala Asn Ser Asn Pro Cys Glu His Ala
41S 420 425
CCA AAA TCT CTC AAC ACG GAT CGC GCC TTC CAC TCT CAC TCT CTC AAG 1344
Cly Lys Cys Val Asn Thr Asp Gly Ala Phe His Cys Clu Cys Leu Lys
430 43S 440 445
CGT TAT CCA CCA CCT CCT TCT CAG ATC CAC ATC AAT CAG TGC CAT TCA 1392
Cly Tyr Ala Gly Pro Arg Cys Clu Met Asp He Asn Glu Cys His Ser
450 455 460
GAC CCC TGC CAC AAT CAT CCT ACC TCT CTC CAT AAC ATT GGA CGC TTC 1440
Asp Pro Cys Gin Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Lys He Gly Gly Phe
465 470 475
ACA TOT CTG TCC ATC CCA CGT TTC AAA CCT CTC CAT TCT GAA TTA CAA 1488
Thr Cys Leu Cys Met Pro Cly Phe Lys Gly Val His Cys Glu Leu Glu
480 46S 490
ATA AAT CAA TCT CAC ACC AAC CCT TCT CTC AAC AAT CGC CAC TCT CTG 1S36
He Asn Clu Cys Cln Ser Asn Pro Cys Val Asn Asn Gly cln Cys Val
495 500 505
CAT AAA CTC AAT COT TTC CAC TCC CTC TCT CCT CCT CCT TTC ACT CGG 1S84
Asp Lys Val Asn Arg Phe Gin Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Cly
510 51S 520 525
CCA CTT TCC CAO ATT CAT ATT GAT CAC TCT TCC AGT ACT CCG TCT CTC 1632
Pro Val Cya Cln He Aap He Aap Asp Cys Ser Ser Thr Pro Cya Leu
530 53S 540
AAT CCG CCA AAC TGT ATC CAT CAC CCC AAT CCC TAT GAA TCC CAO TCT 1680
Asn Cly Ala Lys Cys He Asp His Pro Asn Cly Tyr Clu Cys Cln Cys
545 SSO S55
GCC ACA CCT TTC ACT CCT CTC TTC TCT CAC CAC AAC ATT CAC AAC TCT 1728
Ala Thr Cly Phe Thr Cly Val Leu Cya Clu Clu Aan He Asp Asn Cya
S60 S6S 570
CAC CCC CAT CCT TCC CAC CAT GCT CAC TCT CAC CAT CCT ATT CAT TCC 1776
Asp Pro Asp Pro Cya His His Cly Cln Cys Cln Asp Cly He Asp Ser
575 580 585
TAC ACC TCC ATC TCC AAT CCC CGC TAC ATC CGC CCC ATC TGC ACT CAC 1824
Tyr Thr Cya He Cys Asn Pro Cly Tyr Met Cly Ala He Cys Ser Asp
590 S95 600 60S
CAO ATT CAT CAA TGT TAC AGC ACC CCT TGC CTC AAC CAT CCT CCC TCC 1872
Cln He Asp Clu Cys Tyr Ser Ser Pro Cys Leu Asn Asp cly Arg Cys
610 61S 620
205
ATT CAC CTC CTC AAT CGC TAC CAC TCC AAC TCC CAC CCA CGC ACC TCA 1920
He Asp Leu Val Asn Cly Tyr Cln Cys Asn Cys Cln Pro Cly Thr Ser
625 630 635
CCC CTT AAT TGT CAA ATT AAT TTT GAT GAC TCT GCA ACT AAC CCT TCT 1968
Cly Val Asn Cya Clu He Asn Phe Asp Asp Cys Ala Ser Asn Pro Cys
640 645 650
ATC CAT GGA ATC TGT ATC GAT CCC ATT AAT CCC TAC ACT TCT CTC TCC 2016
He His Cly He Cys Met Aap Cly He Asn Arg Tyr Ser Cys Val cys
65S 660 665
TCA CCA CCA TTC ACA CCG CAC ACA TGT AAC ATT CAC ATT GAT CAG TCT 2064
Ser Pro Cly Phe Thr Cly Cln Arg Cys Asn He Asp He Asp Clu Cya
670 675 680 685
CCC TCC AAT CCC TGT CCC AAC CCT CCA ACA TGT ATC AAC CCT CTC AAT 2112
Ala Ser Asn Pro Cys Arg Lys Cly Ala Thr Cys He Asn Cly Val Asn
690 69S 700
CCT TTC CCC TCT ATA TCC CCC GAG CCA CCC CAT CAC CCC ACC TCC TAC 2160
Cly Phe Arg Cys He Cys Pro Clu Cly Pro His His Pro Ser Cys Tyr
705 710 71S
TCA CAC CTC AAC CAA TCC CTC ACC AAT CCC TCC ATC CAT GCA AAC TCT 2208
Ser Cln Val Aan Clu Cys Leu Ser Asn Pro Cys He His Cly Asn Cys
720 725 730
ACT CCA CCT CTC ACT CCA TAT AAC TCT CTC TCT GAT CCA CGC TCC CTT 2256
Thr Cly Cly Leu Ser Gly Tyr Lye Cys Leu cys Asp Ala Cly Trp Val
735 740 745
CGC ATC AAC TGT CAA CTC CAC AAA AAT CAA TCC CTT TCC AAT CCA TCC 2304
Cly Ile Asn Cya Clu Val Asp Lys Asn Clu Cys Leu Ser Asn Pro Cys
750 755 760 765
CAC AAT CCA CCA ACT TCT GAC AAT CTG GTG AAT CCA TAC ACC TCT ACT 23S2
Cln Asn Cly Cly Thr Cys Asp Asn Leu Val Asn Cly Tyr Arg Cys Thr
770 775 780
TCC AAC AAG CGC TTT AAA CCC TAT AAC TCC CAC CTC AAT ATT GAT CAA 2400
Cya Lys Lys Cly Phe Lys Cly Tyr Asn Cys Cln Val Asn He Asp Clu
785 790 795
TCT CCC TCA AAT CCA TCC CTC AAC CAA CCA ACC TCC TTT GAT CAC ATA 2448
Cys Ala Ser Asn Pro Cya Leu Asn Cln Cly Thr Cys Phe Asp Asp He
800- 805 610
ACT CCC TAC ACT TCC CAC TCT CTC CTC CCA TAC ACA CGC AAC AAT TGT 2496
Ser Cly Tyr Thr Cys His cys val Leu Pro Tyr Thr Cly Lys Asn cys
815 820 825
CAO ACA CTA TTC CCT CCC TCT TCC CCA AAC CCT TCT CAC AAT CCT GCT 2544
Cln Thr Val Leu Ala Pro Cys Ser Pro Aan Pro Cys Clu Asn Ala Ala
830 835 840 .845
CTT TCC AAA GAG TCA CCA AAT TTT GAC ACT TAT ACT TGC TTC TCT CCT 2592
Val Cys Lye Clu Ser Pro Asn Phe Clu Ser Tyr Thr Cya Leu Cys Ala
650 855 860
CCT CCC TCC CAA GGT CAG CGG TGT ACC ATT CAC ATT CAC CAO TCT ATC 2640
Pro Gly Trp Cln Cly Cln Arg Cys Thr He Asp He Asp Clu Cys He
865 870 875
TCC AAG CCC TCC ATC AAC CAT CCT CTC TCC CAT AAC ACC CAC GCC ACC 2688
Set Lye Pro cys Met Asn His Cly Leu Cys Kis Aan Thr Cln Cly Ser
880 865 890
206
TAC ATC TCT GAA TCT CCA CCA CGC TTC AGT GCT ATC CAC TCT CAC CAG
Tyr Met Cys Glu Cys Pro Pro Cly Phe ser Cly Met Asp cya Clu Glu
895 900 90S
2736
CAC ATT GAT GAC TGC CTT GCC AAT CCT TGC CAG AAT CCA GGT TCC TGT
Asp Ile Aap Aap Cys Leu Ala Asn Pro Cys Gin Asn Cly Gly Ser Cys
910 91S 920 925
2784
ATC CAT CCA CTG AAT ACT TTC TCC TCC CTC TCC CTT CCC CCT TTC ACT
Met Asp Gly Val Asn Thr Phe Ser Cys Leu Cys Leu Pro Cly Phe Thr
930 935 940
2832
CCG CAT AAG TGC CAG ACA CAC ATC AAT CAC TCT CTC ACT GAA CCC TCT
Cly Asp Lys Cys Cln Thr Asp Met Asn Clu Cys Leu Ser Clu Pro Cys
945 950 955
2880
AAC AAT CGA GGG ACC TCC TCT GAC TAC CTC AAC ACT TAC ACT TGC AAG
Lys Asn Cly Cly Thr Cys Sec Asp Tyr Val Asn Ser Tyr Thr Cys Lys
960 965 970
2928
TGC CAG GCA CCA TTT CAT CGA CTC CAT TGT CAC AAC AAC ATC AAT CAC
Cys Cln Ala Cly Phe Asp Cly Val His Cys Glu Asn Asn Ile Asn Glu
975 980 985
2976
TGC ACT CAC AGC TCC TGT TTC AAT GCT CCC ACA TGT GTT GAT CCG ATT
Cys Thr Glu Ser Ser Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Cly Ile
990 995 1000 100S
3024
AAC TCC TTC TCT TCC TTC TGC CCT CTC OCT TTC ACT CCA TCC TTC TCC
Asn Ser Phe Ser Cys Leu Cya Pro Val Cly Phe Thr Cly Ser Phe Cya
1010 101S 1020
3072
CTC CAT CAC ATC AAT CAA TCC AGC TCT CAT CCA TCC CTG AAT CAO CCA
Leu His Clu Ile Asn Clu Cys Ser Sec His Pro Cys Leu Asn Glu Cly
1025 1030 1035
3120
ACC TCT CTT CAT CCC CTC CCT ACC TAC CCC TCC ACC TCC CCC CTC CCC
Thr Cys Val Aap Cly Leu Cly Thr Tyr Arg Cys Ser Cys Pro Leu Cly
1040 1045 1050
3168
TAC ACT CCC AAA AAC TCT CAC ACC CTC CTC AAT CTC TCC AGT CCC TCT
Tyr Thr Cly Lys Asn Cys Cln Thr Leu Val Asn Leu Cys Ser Arg Ser
1055 1060 1065
3216
CCA TGT AAA AAC AAA GCT ACT TCT CTT CAC AAA AAA CCA GAG TCC CAG
Pro Cya Lya Asn Lya Gly Thr Cys Val Cln Lys Lys Ala Clu Ser Oln
1070 1075 1080 1085
3264
TGC CTA TCT CCA TCT CCA TCC CCT CGT CCC TAT TCT CAC GTC CCC AAT
Cys Leu Cya Pro Ser Cly Trp Ala Cly Ala Tyr Cys Asp Val Pro Asn
1090 1095 HOO
3312
CTC TCT TCT CAC ATA CCA CCC TCC AGC AGA CCT CTG CTT GTT CAA CAC
Val Sar cys Asp He Ala Ala Sec Arg Arg Cly Val Leu Val Clu Hls
HOS 1110 1115
3360
TTC TCC CAC CAC TCA CGT CTC TCC ATC AAT CCT CCC AAC ACC CAT TAC
Leu Cya Cln Hls Ser Cly Val Cys Ile Asn Ala Gly Asn Thr His Tyr
1120 112S 1130
3408
TCT CAO TCC CCC CTC CCC TAT ACT CGC ACC TAC TCT CAC CAC CAA CTC
Cya Cln Cys Pro Leu Cly Tyr Thr Cly Ser Tyr Cys Clu Clu Cln Leu
1135 1140 1145
34S6
GAT CAC TCT CCC TCC AAC CCC TCC CAC CAC CCG GCA ACA TGC ACT CAC
Asp Clu Cys Ala Ser Asn Pro Cys Cln His Gly Ala Thr Cys Ser Asp
11S0 H55 1160 1165
3S04
207
TTC ATT CCT CCA TAC ACA TCC GAG TCT CTC CCA CCC TAT CAC CCT CTC
Pho Ile Gly Cly Tyr Arg Cys Clu Cys Val Pro Oly Tyr Cln Cly Val
1170 1175 1180
3SS2
AAC TCT GAC TAT CAA CTC CAT CAC TCC CAC AAT CAC CCC TGC CAC AAT
Asn Cys Clu Tyr Clu Val Asp Glu Cys Cln Asn Cln Pro Cys Cln Asn
1185 1190 119S
3600
CGA CCC ACC TGT ATT CAC CTT CTC AAC CAT TTC AAC TCC TCT TGC CCA
Cly Cly Thr Cys Ile Asp Leu Val Asn His Phe Lys Cys Ser Cys Pro
1200 120S 1210
3648
CCA CCC ACT CGC CGC CTA CTC TGT CAA CAC AAC ATT GAT GAC TGT CCC
Pro Gly Thr Arg Cly Leu Leu Cys Clu Clu Asn Ile Asp Asp Cys Ala
1215 1220 1225
3696
CCC CCT CCC CAT TGC CTT AAT CGT GCT CAC TCC ATC CAT AGG ATT CGA
Arg Cly Fro His Cys Leu Asn Cly Cly Cln Cys Met Asp Arg Ile Cly
1230 123S 1240 1245
3744
CGC TAC ACT TCT CCC TCC TTC CCT CCC TTT CCT CCC CAG CCT TCT CAC
Cly Tyr Ser Cys Arg Cys Leu Pro Gly Phe Ala Cly Clu Arg Cys Glu
12S0 12SS 1260
3792
CCA CAC ATC AAC CAC TCC CTC TCC AAC CCC TCC AGC TCT GAC CGC ACC
Cly Asp Ile Asn Clu eye Leu Ser Asn Pro Cys Ser Ser Glu Cly Ser
126S 1270 1275
3840
CTC CAC TCT ATA CAC CTC ACC AAT CAC TAC CTG TCT GTT TCC CCT ACT
Leu Asp cys Ile Gin Leu Thr Asn Asp Tyr Leu Cys Val Cys Arg Ser
1280 1285 1290
3868
GCC TTT ACT CGC CCC CAC TCT CAA ACC TTC CTC CAT CTC TGT CCC CAC
Ala Phe Thr Cly Arg His Cys Clu Thr Phe Val Asp Val Cys Pro Gin
1295 1300 1305
3936
ATC CCC TCC CTC AAT CCA CCC ACT TCT GCT GTG CCC ACT AAC ATC CCT
Met Pro Cys Leu Asn Cly Cly Thr Cys Ala Val Ala Ser Asn Hat Pro
1310 1315 1320 1325
3984
CAT CCT TTC ATT TCC CCT TCT CCC CCO CCA TTT TCC CGC CCA AGG TCC
Asp Cly Phe Ile Cys Arg Cys Pro Pro Cly Phe Ser Cly Ala Arg Cys
1330 133S 1340
4032
CAC ACC AGC TCT GGA CAA CTC AAA TOT AGO AAC CCC CAC CAC TCT CTC
Cln Ser Ser Cys Gly cln Val Lys Cys Arg Lys Cly clu Cln cys Val
1345 1350 1355
4080
CAC ACC CCC TCT CCA CCC CGC TCC TTC TCC CCC ACT CCC CCC CAC TCC
His Thr Ala Ser Cly Pro Arg Cys Phe Cys Pro Ser Pro Arg Asp Cys
1360 1365 1370
4128
CAC TCA CCC TCT CCC ACT ACC CCC TGC CAC CAC GCG CCC ACC TCC CAC
Clu Sec Cly Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin His Cly Cly Ser Cys His
1375 1360 13SS
4176
CCT CAC CCC CAC CCT CCT TAT TAC TCC TCC CAC TCT CCC CCA CCA TTC
Pro Cln Arg Cln Pro Pro Tyr Tyr Ser Cys Cln Cya Ala Pro Pro Phe
1390 1395 1400 1405
4224
TCC CCT ACC CCC TCT CAA CTC TAC ACC CCA CCC CCC ACC ACC CCT CCT
Ser Cly Ser Arg Cys Clu Leu Tyr Thr Ala Pro Pro Ser Thr Pro Pro
1410 1415 1420
4272
CCC ACC TCT CTO ACC CAC TAT TCT CCC CAC AAA CCT CCC CAT CCC CTC
Ala Thr Cys Leu Ser Cln Tyr Cya Ala Asp Lys Ala Arg Asp Cly Val
1425 1430 143S
4320
208
TCT CAT CAC CCC TCC AAC ACC CAT CCC TCC CAC TCC GAT GGG GGT CAC
Cys Asp Clu Ala Cys Asn Ser His Ala Cys Cln Trp Asp Gly Cly Asp
1440 144S 14S0
4368
TCT TCT CTC ACC ATG CAC AAC CCC TCG CCC AAC TCC TCC TCC CCA CTT
Cys Ser Leu Thr Het Clu Asn Pro Trp Ala Asn Cys Ser Ser Pro Leu
145S 1460 146S
4416
CCC TCC TCG GAT TAT ATC AAC AAC CAC TCT CAT CAC CTC TCC AAC ACC
Pro Cys Trp Asp Tyr He Asn Asn Gin Cys Asp Clu Leu Cys Asn Thr
1470 1475 1480 1485
4464
CTC CAG TGC CTC TTT CAC AAC TTT CAA TCC CAG GCG AAC AGC AAG ACA
Val Clu Cys Leu Phe Asp Asn Phe Glu Cys Cln Gly Asn Ser Lys Thr
1490 1495 1500
4512
TCC AAG TAT CAC AAA TAC TGT CCA CAC CAC TTC AAA GAC AAC CAC TCT
Cys Lys Tyr Asp Lys Tyr Cys Ala Asp His Phe Lys Asp Asn Hia Cys
1S0S 1510 1515
4S60
AAC CAO CCC TCC AAC ACT CAC GAC TCT CGT TCC CAT GCC CTC CAC TGT
Asn Cln Cly Cys Asn Ser clu Clu Cys Gly Trp Asp Cly Leu Asp Cya
1520 1525 1S30
4608
CCT CCT CAC CAA CCT CAC AAC CTC CCA CAA CCT ACC CTC GTT ATT GTC
Ala Ala Asp Cln Pro Clu Aan Leu Ala Clu Cly Thr Leu Val He Val
1535 1540 1545
4656
GTA TTC ATC CCA CCT CAA CAA CTC CTC CAC GAT GCT CCC ACC TTC TTG
Val Leu Met Pro Pro Clu Cln Leu Leu Cln Asp Ala Arg Ser Phe Lou
1SS0 1555 1S60 1S6S
4704
CCG CCA CTG CGT ACC CTC CTC CAC ACC AAC CTG CGC ATT AAG CCC CAC
Arg Ala Leu Cly Thr Leu Leu His Thr Asn Leu Arg He Lys Arg Asp
1570 1575 1580
47S2
TCC CAG CCC CAA CTC ATC CTC TAC CCC TAT TAT CCT CAC AAC TCA CCT
Ser Cln Cly Clu Leu Met». Val Tyr Pro Tyr Tyr Cly Glu Lyo Ser Ala
1S8S 1590 159S
4800
GCT ATC AAG AAA CAG ACC ATC ACA CGC AGA TCC CTT CCT GCT CAA CAA
Ala Met Lye Lya Cln Arg Met Thr Arg Arg Ser Leu Pro Cly Clu Cln
1600 160S 1610
4648
CAA CAO GAC CTC CCT CCC TCT AAA CTC TTT CTC CAA ATT GAC AAC CCC
Clu Cln Clu Val Ala Cly Ser Lya Val Phe Leu Clu He Asp Aan Arg
1615 1620 1625
4896
CAC TCT CTT CAA CAC TCA CAC CAC TCC TTC AAG AAC ACC CAT CCA CCA
Cln Cys Val Cln Asp Ser Asp His Cys phe Lys Asn Thr Asp Ala Ala
1630 1635 1640 164S
4944
CCA CCT CTC CTC CCC TCT CAC CCC ATA CAO CCC ACC CTC TCA TAC CCT
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Hia Ala He Gin Cly Thr Leu Ser Tyr Pro
1650 1655 1660
4992
CTT CTC TCT CTC CTC AGT CAA TCC CTC ACT CCA CAA CCC ACT CAO CTC
Leu Val Ser Val Val Ser Clu Ser Leu Thr Pro Clu Arg Thr Cln Leu
166S 1670 1675
5040
CTC TAT CTC CTT CCT CTT CCT CTT CTC ATC ATT CTC TTT ATT ATT CTC
Leu Tyr Leu Leu Ala Val Ala Val Val He He Leu Phe He He Leu
1680 1685 1690
5088
CTC CCG CTA ATC ATG CCA AAA CCA AAC CCT AAC CAT CGC TCT CTC TCC
Leu Cly Val He Met Ala Lys Arg Lys Arg Lys Hls Gly Ser Leu Trp
1695 1700 1705
5136
209
CTG CCT GAA GGT TTC ACT CTT CGC CCA CAT GCA AGC AAT CAC AAG CGT
Leu Pro Clu Gly Phe Thr Leu Arg Arg Asp Ala Ser Asn His Lys Arg
1710 17IS 1720 172S
5184
CGT GAG CCA GTG GGA CAG GAT GCT GTC CGC CTC AAA AAT CTC TCA CTC
Arg Glu Pro Val Gly ein Asp Ala Val Cly Leu Lys Asn Leu Ser Val
1730 173S 1740
S232
CAA CTC TCA GAA GCT AAC CTA ATT GGT ACT GGA ACA AGT GAA CAC TGG
Gin Val Ser Clu Ala Asn Leu He Gly Thr Cly Thr ser Clu Hls Trp
174S 1750 1755
S260
CTC CAT GAT GAA GGC CCC CAC CCA AAG AAA GTA AAG CCT CAA CAT CAC
Val A9p Asp Glu Gly Pro Gin Pro Lys Lys Val Lys Ala Glu A9p Glu
1760 176S 1770
5328
CCC TTA CTC TCA CAA GAA CAT CAC CCC ATT GAT CCA CGC CCA TCG ACA
Ala Leu Leu Ser clu Clu Asp Asp Pro He Asp Arg Arg Pro Trp Thr
177S 1780 178S
5376
CAO CAC CAC CTT GAA CCT GCA GAC ATC CGT ACG ACA CCA TCG CTC GCT
Gin Cln Hia Leu Glu Ala Ala Asp He Arg Arg Thr Pro Ser Leu Ala
1790 179S 1800 1805
S424
CTC ACC CCT CCT CAC CCA CAG CAG GAC CTC CAT CTC TTA CAT CTC AAT
Leu Thr Pro Pro Cln Ala Clu Gin Clu Val Asp Val Leu Asp Val Asn
1810 1815 1820
5472
CTC CCT GGC CCA CAT CGC TGC ACC CCA TTC ATG TTG GCT TCT CTC CCA
Val Arg Gly Pro Asp Cly eye Thr Pro Leu Met Leu Ala Ser Leu Arg
182S 1830 1835
SS20
CGA CGC ACC TCA CAT TTC ACT CAT CAA CAT GAA CAT CCA GAC GAC TCT
Cly Cly Ser Ser Asp Leu Ser Asp Clu Aap Glu Asp Ala Glu Asp Ser
1840 184S 1850
5S68
TCT CCT AAC ATC ATC ACA CAC TTC GTC TAC CAC CGT CCC AGC CTC CAG
Ser Ala Asn He He Thr Aap Leu Val Tyr Cln Cly Ala Ser Leu ein
18S5 1660 1865
5616
CCC CAC ACA GAC CGC ACT CCT CAC ATC CCC CTC CAC CTT CCA CCC CCC
Ala Cln Thr Asp Arg Thr Cly Clu Het Ala Leu His Leu Ala Ala Arg
1870 1875 1880 1885
S664
TAC TCA CGC GCT CAT GCT CCC AAC CCT CTC CTG GAT GCA CCT CCA CAT
Tyr Ser Arg Ala Aap Ala Ala Lya Arg Leu Leu Asp Ala Cly Ala Aap
1890 189S 1900
5712
CCC AAT CCC CAC CAC AAC ATC CGC CGC TCT CCA CTC CAT CCT CCA CTC
Ala Asn Ala Cln Asp Asn Hat Cly Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val
1905 1910 191S
5760
CCA CCT CAT CCC CAA CCT GTC TTC CAG ATT CTC ATT CCC AAC CGA CTA
Ala Ala Asp Ala Cln Cly Val Phe Cln He Leu He Arg Aan Arg Val
1920 1925 1930
5808'
ACT GAT CTA GAT CCC ACC ATG AAT GAT CCT ACT ACA CCC CTG ATC CTC
Thr Aap Leu Asp Ala Arg Met Asn Asp Cly Thr Thr Pro Leu He Leu
1935 1940 1945
5856
CCT CCC CCC CTC CCT CTG CAC CCA ATG CTG GCA CAA CTC ATC AAC TCC
Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Cly Met Val Ala Clu Leu Ile Asn Cys
1950 1955 1960 1965
S904
CAA CCC CAT CTG AAT CCA CTC CAT CAC CAT CGA AAA TCT CCT CTT CAC
Cln Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp His Cly Lys Ser Ala Leu His
1970 1975 1980
5952
210
TCC CCA CCT CCT GTC AAT AAT GTC GAC CCA ACT CTT TTC TTC TTC AAA
Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Clu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Lys
1985 1990 1995
6000
AAT CCC CCC AAC CGA CAC ATC CAC CAC AAC AAG GAA CAC ACA CCT CTC
Asn Cly Ala Asn Arg Asp Met Cln Asp Asn Lys Clu Clu Thr Pro Leu
2000 200S 2010
6048
TTT CTT CCT CCC CCC CAC CCC ACC TAT CAA CCA GCC AAC ATC CTC TTA
Phe Leu Ala Ala Arg Clu Cly Ser Tyr Clu Ala Ala Lys He Leu Leu
201S 2020 2025
6096
CAC CAT TTT CCC AAT CGA CAC ATC ACA CAC CAT ATC CAT CGT CTT CCC
Asp His Phe Ala Asn Arg Asp He Thr Asp His Hec Asp Arg Leu Pro
2030 203S 2040 2045
6144
CCC CAT GTC CCT CGC CAT CGC ATG CAC CAT GAC ATT CTC CCC CTT CTC
Arg Asp Val Ala Arg Asp Arg Met His His Asp He Val Arg Leu Leu
2OS0 20S5 2060
6192
CAT CAA TAC AAT CTC ACC CCA AGC CCT CCA CCC ACC GTC TTC ACT TCT
Aap Clu Tyr Aan Val Thr Pro Ser Pro Pro Gly Thr Val Leu Thr Ser
2065 2070 2075
6240
CCT CTC TCA CCT CTC ATC TCT CCG CCC AAC ACA TCT TTC CTC ACC CTC
Ala Leu Ser Pro Val He Cys Cly Pro Asn Arg Ser Phe Leu Ser Leu
2080 2085 2090
6288
AAC CAC ACC CCA ATC CCC AAC AAC TCT ACA CCG CCC ACT CCC AAC ACT
Lya His Thr Pro Met Gly Lys Lys Ser Arg Arg Pro Ser Ala Lys Ser
2095 2100 2105
6336
ACC ATC CCT ACT ACC CTC CCT AAC CTT CCC AAC CAG CCA AAC CAT CCC
Thr Met Pro Thr Ser Leu Pro Asn Leu Ala Lya Clu Ala Lys Asp Ala
2110 2115 2120 2125
6384
AAC CGT ACT ACC ACG AAC AAC TCT CTC AGT CAC AAC CTC CAA CTC TCT
Lys Cly Ser Arg Arg Lys Lys Ser Leu Ser Glu Lys Val Cln Leu Ser
2130 2135 2140
6432
CAC ACT TCA CTA ACT TTA TCC CCT GTT CAT TCC CTA CAA TCT CCT CAC
Clu Ser Ser Val Thr Leu Ser Pro val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His
214S 2150 21SS
6480
ACC TAT CTT TCC CAC ACC ACA TCC TCT CCA ATG ATT ACA TCC CCT CCG
Thr Tyr val Ser Aap Thr Thr Ser Ser Pro Met He Thr Ser Pro Cly
2160 2165 2170
6528
ATC TTA CAC CCC TCA CCC AAC CCT ATC TTC CCC ACT CCC GCC CCT CCT
He Leu Cln Ala Ser Pro Asn Pro Met Leu Ala Thr Ala Ala Pro Pro
2175 2180 2185
6576
CCC CCA GTC CAT CCC CAC CAT CCA CTA TCT TTT TCT AAC CTT CAT CAA
Ala Pro Val His Ala cln Hia Ala Leu Ser Phe ser Asn Leu His Clu
2190 2195 2200 2205
6624
ATC CAC CCT TTC CCA CAT CCG CCC AGC ACT CTC CTT CCC TCA CTC ACC
Met Cln Pro Leu Ala His Cly Ala Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser
2210 2215 2220
6672
CAC TTC CTA TCC CAC CAC CAC ATT CTC TCT CCA CCC ACT CGC ACT CCT
Cln Leu Leu Ser His Hia His He Val Ser Pro Cly Ser Cly Ser Ala
2225 2230 2235
6720
CGA ACC TTC ACT ACC CTC CAT CCA CTC CCA CTC CCA GCA CAT TCC ATC
Cly Ser Leu Ser Arg Leu His Pro Val Pro Val Pro Ala Asp Trp Met
2240 2245 2250
6768
211
AAC CGC ATG CAC CTC AAT CAC ACC CAC TAC AAT CAC ATC TTT CCT ATC 6816
Aan Arg Het Clu Val Asn Clu Thr Gin Tyr Asn Glu Met Phe Cly Het
22SS 2260 226S
CTC CTC CCT CCA CCT CAG CGC ACC CAT CCT CCC ATA GCT CCC CAC AGC 6864
val Leu Ala Pro Ala Clu Cly Thr His Pro Cly He Ala Pro Cln Ser
2270 2275 2280 228S
ACC CCA CCT CAA CCC AAC CAC ATA ACC ACC CCT CCC CAC CCC TTC CCC 6912
Arg Pro Pro Clu Cly Lys His He Thr Thr Pro Arg Clu Pro Leu Pro
2290 2295 2300
CCC ATT CTC ACT TTC CAC CTC ATC CCT AAA CCC ACT ATT CCC CAA CCA 6960
Pro He Val Thr Phe Cln Leu He Pro Lys Cly Ser He Ala Cln Pro
2305 2310 231S
CCC CCC CCT CCC CAC CCT CAC TCC ACC TCC CCT CCA CCT CTT CCG CCC 7008
Ala Cly Ala Pro Cln pro Cln Ser Thr Cys Pro Pro Ala Val Ala Cly
2320 2325 2330
CCC CTC CCC ACC ATG TAC CAO ATT CCA GAA ATC CCC CCT TTC CCC ACT 7056
Pro Leu Pro Thr Met Tyr Cln He Pro Clu Met Ala Arg Leu Pro Ser
2335 2340 2345
CTC CCT TTC CCC ACT CCC ATC ATC CCC CAC CAC CAC GCC CAC CTA CCT 7104
Val Ala Phe Pro Thr Ala Met Met Pro Cln Cln Asp Gly Cln Val Ala
23S0 2355 2360 2365
CAO ACC ATT CTC CCA CCC TAT CAT CCT TTC CCA CCC TCT CTC CCC AAG 7152
Gin Thr He Leu Pro Ala Tyr His Pro Phe Pro Ala Ser Val Cly Lys
2370 2375 2380
TAC CCC ACA CCC CCT TCA CAG CAC ACT TAT CCT TCC TCA AAT CCT CCT 7200
Tyr Pro Thr Pro Pro Ser Cln His Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Ala Ala
238S 2390 2395
GAC CCA ACA CCC ACT CAC ACT CCT CAC CTC CAC CGT GAG CAT CCC TAC 7248
Clu Arg Thr Pro Sec His Ser cly His Leu Cln Cly Clu His Pro Tyr
2400 2405 2410
CTG ACA CCA TCC CCA CAG TCT CCT CAC.CAC TCG TCA AGT TCA TCA CCC 7296
Leu Thr Pro Ser Pro Clu Ser Pro Asp Cln Trp Ser Ser Sec Ser Pro
2415 2420 2425
CAC TCT CCT TCT CAC TCC TCA CAT CTC ACC ACC ACC CCT ACC CCT CCC '7344
His Ser Ala Ser Asp Trp Ser Asp val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Cly
2430 2435 2440 2445
CCT CCT GCA CGA CCT CAC CCC GCA CCT CCC ACA CAC ATC TCT GAO CCA 7392
Gly Ala Oly Gly Cly Gin Arg Cly Pro Gly Thr His Met Ser Clu Pro
2450 245S 2460
CCA CAC AAC AAC ATC CAC GTT TAT CCC TCAGACACTC CACCTCCACT 7439
Pro His Asn Asn Met Cln Val Tyr Ala
246S 2470
CTAGAGACAT AACTCACTTT TCTAAATCCT CCTGACCAAC AAATGAACCT CATCCCCCAC 7499
AGAAATCAAC AAATCTCTCG ACCCAGCTTC TACACCTACC AAACACAACA TCTTCTTATT 7559
CACATAATCC AACACAAGCA ATTCCTCACT TTCACTCCCT ATCTCCAACG CTTATTCATT - 7619
ATTCTAATCT AATAACACAA CTTTCTGCAA ATCCAAOATC AATACAACCC TTCCCTCCAT 7679
CTTTACTCTC TTCTATTTCC ACAATAAGAT CCATCCTTAT TGAACCCCAO ACATTCTTGC 7739
ACCTTCCACT CCATTTTAAC CCCTCCACGC TTCTCCCATA TCCATCAGAA CATTCTACAC 7799
212
TACCCTCCTC TTCCGAATTA TCCCCTCGAA TTCTCCCTCA ATTCACCTAC CCATCTCCTC 78S9
CTCCTTCCAC ATTCTTTTCT CTTCATTTGG TGCTTTTCCT TTTCCACCTC TCCCTCATTC 7919
TACCCCTACC ACCATCTTAT ACCCCAACAC CTTTCTCCTT TTCATCATTC TCCCCCATCA 7979
AACCAACTTT CCTCTCCTTT CCCCTCCTCT CTTCCCCCTA TCCCTTCCAC TCTCACAACC 8039
TTTACTTTCG TATCCTTCTC ACCACAAACC TTTCAACTAT CTTGTTTCTT TCCAAAATCC 8099
ACATACTCTA TTCTCTTCTC CTCCATATAT CATTCCTOCA CACACAACCG CACAACAATA 81S9
CTTTTCTTCA ACAAATTTTC CCCCCACGAC ATCCCTTCAA GACGCTCCAC CTTAATTTTT 8219
CTTCTCTCTC TGCACCTCTT CATATAAACT TTACCACCAA CAACCCTCTC ACTTTCTTCT 8279
TTTTCTGTGT ATGCGCCTGG TCACTGTAAA GTTTTATCCT TCATAGTCTA GTTACTATGA 8339
CCCTCCCCAC TTTTTTAAAA CCACAAAAAC CTTTGCAATC TTCCAATCAC CAACAGACAA 8399
GTTAACTCCT GCAACACCCA GTTACCCACC CACACCTCCC CCTACTTCCT CCCAAGCATT 84S9
CCATTCACTC CCTCTATGGA ACACATTTCT CCCACATCTC ACCATTCTAC CCCTCTTTCA 8S19
CTCACTCACC CAGCATATGA AACTAGTCTT AACTCTTCAC CCTTTCCTTT CATATCCACA 8579
CAACACACTC TCTCAAATGT TGTACCCTTC CCATTTACOA CTGAACTTTC CTTACCCCAA 8639
CCCACCCAGT CACACTTCTC TTCCCTTTCT CACATCATCA CTCTCTACTC ATTATCTTCC 8699
TCCTTAAAGC CCTCCTCACC AATCTTTCTT TCACACCGTC TCGTCCCTCT TACTCGTATA 8759
CCCACTATCT TCTCACTCAA CACATCGACT TTATATCTTC AACTCCACCA ATTCCAAACT 8819
TCCACTTCTT TTCTATCATC CAAAACAGCC CTATAACAAC CTTCCAAAAC CACCAACTAT 8879
ATACCACCCT TTGCTATTTT CTCCTACCAT TTCTTTTCCT CTCAAGCCCC CATCACATTC 8939
CCTTTCCCAA CTAACCTACA AACTCAACAC AACATTTTCC TTTCCTAGAG TCACCTTTTA 8999
CATCATAATG CACAACTATA CACTTGCTCA TTCTTCACAC TGATTGCCCC TCACCTGAAT 90S 9
CCACTCTCTC TATTCATCCT CTTCGCAATT TCTTTCACTT TCTTTTAACC CCAGAACCAT 9119
TTTACTTAAT TCTACATAAA CAATACTTTT ITrCÜTCITC TCCTTCCCCC AGTTAATAAT 9179
TCCTCCATCC CTACACTCCA ACTTCCGTCC ACTCCTCTCA TGCCCATCAC ACCTCCAAAA 9239
TAAOTTCTCC CTCCCCATTT TCTACATATT AACAGGTGAA TTCCCCACTC TTTTCCTTTC 9299
AATCACAOTT CTCATTCCTT CTATCCCTCC AACTATCCAT CACTCCTTCC CACTTACCTO 9359
ATTTCTCTCT CGCTCGCCCC ATATCCAAAC CCTCCCTCTC TGTTCCCATA ATAOTTTACA 9419
AATCCTTTTT TCACTCCTAT CCAAATTTAT TCAACCAACA AAAATAATTA CTTCTCCCCT 9479
CACATAACCA CATTAACTTT CTTCATTCTC TCCTTTATTC TCTCCATGTO CCAACATTCT 9539
CTCACCCTCT TTCATACTCT CCAAACATTT TATCATTCTA AATCCTCACT CTCTOCCCTT 9S99
CCACCCATTT ATTATTCACA CATCCCGAGA ACCTATCTCC ATCCACCCTC ACCATCCTCT 9659
CTCCACCACA CACACTCCAC CCACCCACTG CCGATCCCGA TCACTTTCTT CCCCTCCCAA 9719
TTCC 9723
REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur
acceptable sur le plan pharmaceutique et une quantité
efficace sur le plan thérapeutique d'un anticorps anti
5 protéine Serrate.
2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, dans
laquelle l'anticorps est polyclonal.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, dans
laquelle l'anticorps est monoclonal.
10 4. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des
revendications 1 à 3, dans laquelle l'anticorps concerne un
domaine de la protéine Serrate qui se lie à Notch.
5. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur
acceptable sur le plan pharmaceutique et une quantité
15 efficace sur le plan thérapeutique d'un fragment d'un
anticorps anti protéine Serrate, lequel fragment contient le
domaine de liaison de l'anticorps, lequel anticorps est tel
que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur
20 acceptable sur le plan pharmaceutique et une quantité
efficace sur le plan thérapeutique d'un acide nucléique
antisens de Serrate.
7. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des
revendications 1 à 6 dans laquelle l'anticorps, le fragment
25 de l'anticorps, ou l'acide nucléique antisens,
respectivement, est purifié.
8. Anticorps tel que défini dans l'une quelconque des
revendications 1 à 4 et 7, un fragment d'un anticorps tel
que défini dans la revendication 5 ou la revendication 7, ou
un acide nucléique antisens tel que défini dans la
revendication 6 ou la revendication 7, destiné à être
utilisé comme médicament.
9. Utilisation d'un anticorps tel que défini dans l'une des
5 revendications 1 à 4 et 7, un fragment d'un anticorps tel
que défini dans la revendication 5 ou la revendication 7, ou
un acide nucléique antisens tel que défini dans la
revendication 6 ou la revendication 7, pour la fabrication
d'un médicament destiné à traiter ou à prévenir une tumeur
10 maligne chez un sujet.
»? \->
* :nled;17.05-2004 DRAW EP01120663.8
'-'0-4-4 PCT/LS93/0933X
^O - Munich
67
J/68 3i"U92QQ\
GAATTCGGAG GAATTATTCA AAACATAAAC ACAATAAACA ATTTGAGTAG TTGCCGCACA 60
CACACACACA CACAGCCCGï GGATTATIAC ACTAAAAGCG ACACTCAATC CAAAAAATCA I20
GCAACAAAAA CATCAATAAA C ATG CAT TGG Alf AAA TGT TTA TTA ACA GCA 17!
Met His irp He Lys Cys Leu Leu Thr Ala
1 5 10
TTC ATT TGC TTC ACA GTC ATC GTG CAG GTT CAC AGT TCC GGC AGC TTT 219
Phe lie Cys Phe Thr Val He Vol Gin Vol His Ser Ser Gly Ser Phe
15 20 25
GAG TTG CGC CTG AAG TAC TTC AGC AAC GAT CAC GGG CGG GAC AAC GAG 267
Glu Leu Arg Leu Lys Tyr Phe Ser Asn Asp His Gly Arg Aso Asn Glu
30 35 40
GGT CGC TGC TGC AGC GGG GAG TCG GAC GGA GCG ACG GGC AAG TGC CTG 3:5
Gly Arg Cys Cys Ser Gly Glu Ser Asp Gly Ala Thr Gly Lys Cys Leu
45 50 55
«A <
GGC AGC TGC AAG ACG CGG TTT CGC GTC TGC CTA AAG CAC TAC CAG GCC
Gly Ser Cys Lys Thr Arg Phe Arg Vu I Cys Leu Lys His Tyr Gin AIq
60 65 70
ACC ATC GAC ACC ACC TCC CAG TGC ACC TAC GGG GAC GTG ATC ACG CCC K '.
Thr lie Asp Thr Thr Ser Gin Cys Thr Tyr Gly Asp VqI lie Thr Pro
75 80 85 90
ATT CTC GGC GAG AAC TCG GTC AAT CTG ACC GAC GCC CAG CGC TTC CAG «59
He Leu Gly Glu Asn Ser Val Asn Leu Thr Asp AIq Gin Arg Phe Gin
95 100 105
AAC AAG GGC TTC ACG AAT CCC ATC CAG TTC CCC TTC TCG TTC TCA TGG 507
Asn Lys Gly Phe Thr Asn Pro lie Gin Phe Pro Phe Ser Phe Ser Trp
110 115 120
FIG. 1A
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
f>rinted:17-05-2004 DRAW EP01120663.8
r' ' ..? ,J/07J-4 PCT/LS9J/09W8
I
2/68
CCG GGT ACC TTC TCG CTG ATC GTC GAG GCC TGG CAT GAT ACG AAC AAT 555
Pro Gly Thr Phe Ser Leu Me Vul Glu Ala Tro His Aso Thr Asn Asn
125 130 135
AGC GGC AAT GCG CGA ACC AAC AAG CTC CTC ATC CAG CGA CTC TTG GTG 603
Ser Gly Asn AIq Arg Thr Asn Lys Leu Leu fie Gin Arg Leu Leu Vol
140 145 150
CAG CAG GTA CTG GAG GTG TCC TCC GAA TGG AAG ACG AAC AAG TCG GAA 651
Gin Gin Vol Leu Glu Val Ser Ser Glu Trp Lys Thr Asn Lys Ser Glu
155 160 165 170
TCG CAG TAC ACG TCG CTG GAG TAC GAT TTC CGT GTC ACC TGC GAT CTC 699
Ser Gin Tyr Thr Ser Leu Glu Tyr Asp Phe Arg VqI Thr Cys Asp Leu
175 18Û 185
AAC TAC TAC GGA TCC GGC TGT GCC AAG TTC TGC CGG CCC CGC GAC GAT 747
Asn Tyr Tyr Gly Ser Gly Cys Alu Lys Phe Cys Arg Pro Arg Asp Asp
190 195 200
TCA TTT GGA CAC TCG ACT TGC TCG GAG ACG GGC GAA ATT ATC.TGT TTG 795
Ser Phe Gly His Ser Thr Cys Ser Glu Thr Gly Glu He He Cys Leu
205 210 215
ACC GGA TGG CAG GGC GAT TAC TGT CAC ATA CCC AAA TGC GCC AAA GGC 843
Thr Gly Trp Gin Gly Asp Tyr Cys His He Pro Lys Cys AIq Lys Gly
220 225 230
TGT GAA CAT GGA CAT TGC GAC AAA CCC AAT CAA TGC GTT TGC CAA CTG 891
Cys Glu His Gly His Cys Asp Lys Pro Asn Gin Cys Val Cys Gin Leu
235 240 245 250
GGC TGG AAG GGA GCC TTG TGC AAC GAG TGC GTT CTG GAA CCG AAC TGC 939
Gly Trp Lys Gly AIq Leu Cys Asn Glu Cys VqI Leu Glu Pro Asn Cys
255 260 265
FIG. 1B
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
Printed: 17-05-2004
N
DRAW EP01120663.8
/O-4-4 PCT/LS93/0933H
3/68
ATC CAT GGC ACC TGC AAC AAA CCC TGG ACT TGC ATC TGC AAC GAG GGT =87
He His Gly Thr Cys Asn Lvs Pro ~\ro Thr Cys He Cys Asn Glu Gly
270 275 ' 280
TGG GGA GGC TTG TAC TGC AAC CAG GAT CTG AAC TAC TGC ACC AAC CAC JG35
Trp Gly Gly Leu Tyr Cys Asn Gin Aso Leu Asn Tyr Cys Thr Asn His
285 290 295
AGA CCC TGC AAG AAT GGC GGA ACC TGC TTC AAC ACC GGC GAG GGA TTG 1083
Arg Pro Cys Lys Asn Gly Gly Thr Cys Phe Asn Thr Gly Glu Gly Leu
300 305 310
TAC ACA TGC AAA TGC GCT CCA GGA TAC AGT GGT GAT GAT TGC GAA AAT î i31
Tyr Vr\r Cys Lys Cys AIq Pro Gly Tyr Ser Gly Asp Asp Cys Glu Asn
315 320 325 330
GAG ATC TAC TCC TGC GAT GCC GAT GTC AAT CCC TGC CAG AAT GGT GGT il79
Glu He Tyr Ser Cys Asp AIq Asp VqI Asn Pro Cys Gin Asn Gly Gly
335 340 345
ACC TGC ATC GAT GAG CCG CAC ACA AAA ACC GGC TAC AAG TGT CAT TGC 1227
Thr Cys He Asp Glu Pro His Thr Lys Thr Gly Tyr Lys Cys His Cys
350 355 360
GCC AAC GGC TGG AGC GGA AAG ATG TGC GAG GAG AAA GTG CTC ACG TGT 1275
AIq Asn Gly Trp Ser Gly Lys Met Cys Glu Glu Lys VqI Leu Thr Cys
365 370 375
TCG GAC AAA CCC TGT CAT CAG GGA ATC TGC CGC AAC GTT CGT CCT GGC 1323
Ser Asp Lys Pro Cys His Gin Gly He Cys Arg Asn VqI Arg Pro Gly
380 385 390
TTG GGA AGC AAG GGT CAG GGC TAC CAG TGC GAA TGT CCC ATT GGC TAC 1371
Leu Gly Ser Lys Gly Gin Gly Tyr Gin Cys Glu Cys Pro He Gly Tyr
395 400 405 410
FIG. 1C
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
nRAW EP01120663.8
Printed:17-05-20_044/0.4.4 DRAW PCT/LS9.V0933S
4/68
AGC GGA CCC AAC TGC GAT CTC CAG CTG GAC AAC TGC AGT CCG AAT CCA H!9
Ser Gly Fro Asn Cys Asp Leu Gin Leu Asp Asn Cys Ser Pro Asn Pro
415 420 425
TGC ATA AAC GGT GGA AGC TGT CAG CCG AGC GGA AAG TGT ATT TGC CCA ]467
Cys He Asn Gly Gly Ser Cys Gin Pro Ser Gly Lys Cys He Cys Pro
430 435 440
GCG GGA TTT TCG GGA ACG AGA TGC GAG ACC AAC ATT GAC GAT TGT CTT 15I5
Ala Gly Phe Ser Gly Thr Arg Cys Glu Thr Asn He Asp Asp Cys Leu
445 450 455
GGC CAC CAG TGC GAG AAC GGA GGC ACC TGC ATA GAT ATG GTC AAC CAA 1563
Gly His Gin Cys Glu Asn Gly Gly Thr Cys He Asp Met Val Asn Gin
460 465 470
TAT CGC TGC CAA TGC GTT CCC GGT TTC CAT GGC ACC CAC TGT AGT AGC I6ll
Tyr Arg Cys Gin Cys VqI Pro Gly Phe His Gly Thr His Cys Ser Ser
475 480 485 490
AAA GTT GAC TTG TGC CTC ATC AGA CCG TGT GCC AAT GGA GGA ACC TGC 1659
Lys VqI Asp Leu Cys Leu He Arg Pro Cys AIq Asn Gly Gly Thr Cys
495 500 505
TTG AAT CTC AAC AAC GAT TAC CAG TGC ACC TGT CGT GCG GGA TTT ACT 1707
Leu Asn Leu Asn Asn Asp Tyr Gin Cys Thr Cys Arg AIq Gly Phe Thr
510 515 520
GGC AAG GAT TGC TCT GTG GAC ATC GAT GAG TGC AGC AGT GGA CCC TGT 1755
Gly Lys Asd Cys Ser Val Asp lie Asp Glu Cys Ser Ser Gly Pro Cys
525 530 535
CAT AAC GGC GGC ACT TGC ATG AAC CGC GTC AAT TCG TTC GAA TGC GTG 1803
His Asn Gly Gly Thr Cys Met Asn Arg VqI Asn Ser Phe Glu Cys Val
540 545 550
FIG.1D
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
Printed: 17-05-2004 DRAW EP01120663.8
>. wuv-j/O-J-4 PCT/LS93/0933X
5/68
TGT GCC AAT GGT TTC AGG GGC AAG CAG TGC GAT GAG GAG TCC TAC GA7 IS5i
Cys Ala Asn Gly Phe Arg Gly Lys Gin Cys Asp Glu Glu Ser Tyr Asc
555 ' 560 565 57C
TCG Giu ACC IK GAT GCC CAC CAA TAT GGA GCG ACC ACA CAA GCG AGA ï899
Ser VqI Thr Phe Asp Ala His Gin Tyr Gly Ala Thr Thr Gin AIq Arc
575 580 585
GCC GAT GGT TTG ACC AAT GCC CAG GTA GTC CTA ATT GCT GTT TTC TCC I947
AIq Aso Gly Leu Thr Asn AIq Gin VqI VqI Leu He AIq VqI Phe Ser
590 595 600
GTT GCG ATG CCT TTG GTG GCG GTT ATT GCG GCG TGC GTG GTC TTC TGC !99:
Val Ala Met Pro Leu VqI AIq VqI He Ala Ala Cys Vol VqI Phe Cys
605 610 615
V ? w
ATG AAG CGC AAG CGT AAG CGT GCT CAG GAA AAG GAC GAC GCG GAG GCC 234
Met Lys Arg Lys Arg Lys Arg AIq Gin Glu Lys Asp Asp AIq Glu Ala
620 625 630
AGG AAG CAG AAC GAA CAG AAT GCG GTG GCC ACA ATG CAT CAC AAT GGC 209:
Arg Lys Gin Asn Glu Gin Asn AIq Vol AIq Thr Met His His Asn Gly
635 640 645 650
*»s ? *s*\
AGT GGG GTG GGT GTA GCT TTG GCT TCA GCC TCT CTG GGC GGC AAA ACT
Ser Gly VqI Gly VqI AIq Leu Ala Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Thr
655 660 665
GGC AGC AAC AGC GGT CTC ACC TTC GAT GGC GGC AAC CCG AAT ATC ATC 2!87
Gly Ser Asn Ser Gly Leu Thr Phe Asp Gly Gly Asn Pro Asn Ile Ile
670 675 680
AAA AAC ACC TGG GAC AAG TCG GTC AAC AAC ATT TGT GCC TCA GCA GCA 2235
Lys Asn Thr Trp Asp Lys Ser VqI Asn Asn Ile Cys AIq Ser AIq AIq
685 690 695
FIG. 1E
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
Printed:17-05-2004 DRAW EP01.120663.8
^ WUV4/0-J-4 PCT/LS93/0933S
6/68
GCA GCG GCG. GCG GCG GCA GCA GCG GCG GAC GAG TGT CTC ATG TAC GGC 2283
AIq AIq AIq AIq AIq AIq AIq AIq Ala Asp Glu Cys Leu Met Tyr Gly
700 705 7I0
GGA TAT GTG GCC TCG GTG GCG GAT AAC AAC AAT GCC AAC TCA GAC TTT 2331
Gly Tyr Vu! AIq Ser Val Ala Asp Asn Asn Asn Ala Asn Ser Aso Phe
715 720 725 * 730
TGT GTG GCT CCG CTA CAA AGA GCC AAG TCG CAA AAG CAA CTC AAC ACC 2379
Cys Val Ala Pro Leu Gin Arg Ala Lys Ser Gin Lys Gin Leu Asn Thr
735 740 745
GAT CCC ACG CTC ATG CAC CGC GGT TCG CCG GCA GGC AGC TCA GCC AAG 2427
Asp Pro Thr Leu Met His Arg Gly Ser Pro AIq Gly Ser Ser AIq Lys
750 755 760
GGA GCG TCT GGC GGA GGA CCG GGA GCG GCG GAG GGC AAG AGG ATC TCT 2^75
Gly Ala Ser Gly Gly Gly Pro Gly Ala Ala Glu Gly Lys Arg Ile Ser
765 770 775
GTT TTA GGC GAG GGT TCC TAC TGT AGC CAG CGT TGG CCC TCG TTG GCG 2523
Val Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Cys Ser Gin Arg Trp Pro Ser Leu Ala
780 785 790
GCG GCG GGA GTG GCC GGA GCC TGT TCA TCC CAG CTA ATG GCT GCA GCT 257:
Ala Ala Gly Vol Ala Gly Ala Cys Ser Ser Gin Leu Met Ala Ala Ala
795 800 805 810
TCG GCA'GCG GGC AGC GGA GCG GGG ACG GCG CAA CAG CAG CGA TCC GTG 2619
Ser Ala AIq Gly Ser Gly AIq Gly Thr Ala Gin Gin Gin Arg Ser Val
815 820 825
GTC TGC GGC ACT CCG CAT ATG TAACTCCAAA AATCCGGAAG GGCTCCTGGT 2670
Vol Cys Gly Thr Pro His Met
830
AAATCCGGAG AAATCCGCAT GGAGGAGCTG ACAGCACATA CACAAAGAAA AGACTGGGTT 2730
GGGTTCAAAA TGTGAGAGAG ACGCCAAAAT GTTGTTGTTG ATÎGAAGCAG TTTAGTCGTC 2790
ACGAAAAATG AAAAATCTGT AACAGGCATA ACTCGTAAAC TCCCTAAAAA ATTTGTATAG 2250
TAATTAGCAA AGCTGTGACC CAGCCGTTTC GATCCCGAAT TC
****** «%
FIG. IF
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
l.oMINMg
2. A Sph
3.AClo
4.AEGF(7-17)
5.A£GF(9-26)
6.AEGF(17-30)
7.A£GF(7-9)
8.AEGF(9-17)
9.AEGF(17-26)
10.AEGF(26-30)
11-AEGF(9-30)
12AEGF(7-26)
UACIo+EGF(9-l7)
14^Clo+EGF(l7-26)
15.SPUT
I6ACIotEGF(9-13)
7/68
SP ECF
TM
% D'AGREGATION -v.
AVEC Ol AVEC Ser i
32
H
31
7 17
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17 31
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7
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25
A
Printed: 17-05-2004
^ v\ o 94/0-4-4
DRAW
8/68
71115 3!
i7.AClo+£GF(i;-15) lHQIID Am ___flïïTP"
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EP01120663.8
PCT/LS93/0933X
3 0 >
7 13 17 31
i8.acio+egf(i3-i7) coiniiuinL_jm
7IO13 3,
!9.ACio+EGF(lG-13) CLTIÏÏÏHJIEÜ______OHILT
7H13 31
20.AClo+EGF(11-i3) OMIlJILl____Jin
7IO12 l\
21.ACIo+EGF(iO-12) rani jn J._____fn
22. ACIa+EGF(10-11) aMU
7IO11 31
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1 9 17
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1 913
27.AEGF+EGF(9-13) mi_rnn ___'" ' | »"ii yA n 1 40 nl
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28.AEGF+EGF(10-13)
29.AEGF+EGF(10-12)
30.AECN
31.AECN+EGF(10-13)
32.AECN+EGF(10-12)
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24.ACIa+EGF(ll-i2) mïïnnjni_____1111111 1 | min va n 1 11 nt
FIG.2B
8
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
31-08-2001
Printed: 17-05-2004
wo 94/0-4-4
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EP01120663.8
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Printed: 17-05-2004
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Printed: 17-05-2004
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Printed: 17-05-2004
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^ WO 94/O-4-4 PCT/LS93/0933X
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FIG.8A
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181 AACCCGGAAC TGAAGGCTGG CTCTCACCCT CTAGGCAGAG CAGGAATTCC GAGGTGGA7G
341 TGTTAGATGT GAATGTCCGT GGCCCAGATG GCTGCACCCC ATTGATGTTG GüKlCïCC
301 GAGGAGGCAG CTCAGAÎTTG AGTGATGAAG ATGAAGATGC AGAGGACTGT TCTGCTAACA
361 TCATCACAGA CTTGGTCTAC CAGGGTGCCA GCCTCCAGAC CAGACAGACC GGACTGGTGA
421 GATGGCCCTG CACCTÎGCAG CCCGCTACTC ACGGGCTGAT GCÎGCCAAGC GTCTCCTGGA
481 TGCAGGTGCA GATGCCAATG CCCAGGACAA CATGGGCCGC TGTCCACTCC ATGCTGCAGT
541 GGCACGTGAT GCCAAGGTGT ATTCAGATCT GTTA
FIG.8B
1 TCCAGATTCÎ GAÎTCGCAAC CGAGTAACTG ATCTAGATGC CAGGATGAAT GATGGTACTA
61 CACCCCTGAT CCTGGCTGCC CGCCTGGCTG TGGAGGGAAT GGTGGCAGAA CTGATCAACT
121 GCCAAGCGGA TGTGAATGCA GTGGATGACC ATGGAAAATC TGCTCTTCAC TGGGCAGCTG
181 CTGTCAATAA TGTGGAGGCA ACTCTTTTGT TGTTGAAAAA TGGGGCCAAC CGAGACATGC
241 AGGACAACAA GGAAGAGACA CCTCTGTTTC TTGCTGCCCG GGAGGAGCTA TAAGC
FIG.8C
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HO 94/0'J-J PCT/LS93/0933X
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1 GAATTCCATT CAGGAGGAAA GGGTGGGGAG AGAAGCAGGC ACCCACTTTC CCGTGGCiGG
61 ACTCGTTCCC AGGTGGCTCC ACCGGCAGCT GTGACCGCCG CAGGTGGGGG CGGAGTGCCA
121 TTCAGAAAAT TCCAGAAAAG CCCTACCCCA ACTCGGACGG CAACGTCACA CCCGTGGGTA
181 GCAACTGGCA CACAAACAGC CAGCGTGTCT GGGGCACGGG GGGATGGCAC CCCCTGCAGG
241 CAGAGCTG
FIG.9A
1 CTAAAGGGAA CAAAAGCNGG AGCTCCACCG CGGGCGGCNC NGCTCTAGAA CTAC7GG-VN
61 NCCCGGGCTG CAGGAATTCC GGCGGACTGG GCTCGGGCTC AGAGCGGCGC TGTGGAAG<-G
121 ATTCTAGACC GGGAGAACAA GCGAATGGCT GACAGCTGGC CTCCAAAGTC AC-GAGGLE
181 AATCGCTCGC CCTGGACATC GAGGGATGCA GAGGATCAGA ACCGGTACCT ggatggca':
241 actcggattt acaagcatga ccagcctgct tacagggagc gtganntttt CACATGCAC*
301 CGACAGACAC GAGCTCTATG CAT
FIG.9B
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Printed: 17-05-2004 DRAW
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Printed: 17-05-2004
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Printed: 17-05-2004
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31
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
31-08-2001
Printed: 17-05-2004 DRAW
..w ,-,/0"4"4
32/68
EP01120663.8
PCT/LS93/0933N
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CJ CJ o * CJ co O -fc CJ ro (J
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SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
32
31-08-2001
Printed: 17-05-2004
? » yj ?»-«/ 0~4~4
DRAW
33/68
EP01120663.8
PCT/LS93/0933X

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cv
ro
8
co
CD
33
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
31-08-2001
Printed-17-05-2004 DRAW EP01120663.8
r-nniea.1 / UD <iUU*;-4-4 PCT/l S93/0933N
34/68
G GAG GTG GAT GTG TTA GAT GTG AAT GTC CGT GGC CCA GAT GGC TGC 46
Glu VqI Asp VqI Leu Asd Vol Asn Val Arg Gly Pro Aso Gly Cys
1 5 10 15
ACC CCA TTG ATG TTG GCT TCT CTC CGA GGA GGC AGC TCA GAT TTG AGT 94
Thr Pro Leu Met Leu Aio Ser Leu Arg Gly Gly Ser Ser Asp Leu Ser
20 25 50
GAT GAA GAT GAA GAT GCA GAG GAC TCT TCT GCT AAC ATC ATC ACA GAC 142
Asp Glu Asp Glu Asp AIq Glu Asp Ser Ser AIq Asn He Ile Thr Aso
35 40 45
TTG GTC TAC CAG GGT GCC AGC CTC CAG GCC CAG ACA GAC CGG ACT GGT ï90
Leu Val Tyr Gin Gly AIq Ser Leu Gin Aio Gin Thr Aso Arg Thr Gly
50 55 60
GAG ATG GCC CTG CAC CTT GCA GCC CGC TAC TCA CGG GCT GAT GCT GCC 238
Glu Met AIq Leu His Leu AIq AIq Arg Tyr Ser Arg AIq Asp AIq AIq
65 70 75
AAG CGT CTC CTG GAT GCA GGT GCA GAT GCC AAT GCC CAG GAC AAC ATG 286
Lys Arg Leu Leu Asp AIq Gly Ala Asp AIq Asn AIq Gin Asp Asn Me*
80 85 90 95
GGC CGC TGT CCA CTC CAT GCT GCA GTG GCA GCT GAT GCC CAA GGT GTC 334
Gly Arg Cys Pro Leu His AIq AIq VqI AIq AIq Asp AIq Gin Gly Vol
100 105 HO
TTC CAG ATT CTG ATT CGC AAC CGA GTA ACT GAT CTA GAT GCC AGG ATG 382
Phe Gin He Leu He Arg Asn Arg Val Thr Asp Leu Asp AIq Arg Met
115 120 125
AAT GAT GGT ACT ACA CCC CTG ATC CTG GCT GCC CGC CTG GCT GTG GAG 430
Asn Asp Gly Thr Thr Pro Leu He Leu AIq AIq Arg Leu Ala Vol Glu
130 135 140
34
FIG. 11A
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
Printed:17-05-2004/0-,-j DRAW EP01120663.8
r'CT/Lo'j'j/uvjJX
m
35/68
GGA ATG GTG GCA GAA CTG ATC AAC TGC CAA GCG GAT G7G AAT GCA GTG 478
Gly Met VqI AIq Glu Leu Ile Asn Cys Gin AIq Aso VqI Asn AIq VqI
145 150 I55
GAT GAC CAT GGA AAA TCT GCT CTT CAC TGG GCA GCT GCT GTC AAT AAT 526
Asp Asp His Gly Lys Ser AIq Leu His Trp AIq AIq AIq VqI Asn Asn
160 165 170 175
GTG GAG GCA ACT CTT TTG TTG TTG AAA AAT GGG GCC AAC CGA GAC ATG 574
VqI Glu AIq Thr Leu Leu Leu Leu Lys Asn Gly AIq Asn Arg Asp Met
180 I85 190
CAG GAC AAC AAG GAA GAG ACA CCT CTG TTT CTT GCT GCC CGG GAG GGG 622
Gin Asp Asn Lys Glu Glu Thr Pro Leu Phe Leu AIq AIq Arg Glu Gly
195 200 205
AGC TAT GAA GCA GCC AAG ATC CTG TTA GAC CAT UJ GCC AAT CGA GAC 670
Ser Tyr Glu AIq AIq Lys Ile Leu Leu Asp His Phe AIq Asn Arg Asp
210 2I5 220
ATC ACA GAC CAT ATG GAT CGT CTT CCC CGG GAT GTG GCT CGG GAT CGC 7!8
He Thr Asp His Met Asp Arg Leu Pro Arg Asp VqI AIq Arg Asp Arg
225 230 235
7C~
1 WW
ATG CAC CAT GAC ATT GTG CGC CTT CTG GAT GAA TAC AAT GTG ACC CCA
Met His His Asp lie VqI Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Val Thr Pro
240 245 250 255
AGC CCT CCA GGC ACC GTG TTG ACT TCT GCT CTC TCA CCT GTC ATC TGT 8i*
Ser Pro Pro Gly Thr Vol Leu Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val He Cys
260 265 270
GGG CCC AAC AGA TCT TTC CTC AGC CTG AAG CAC ACC CCA ATG GGC AAG 862
Gly Pro Asn Arg Ser Phe Leu Ser Leu Lyn His Thr Pro Met Gly Lys
275 280 285
FIG. 11B
35 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) -31-08-2001
Printed: 17-05-2004
.. ^ ,4/0"4 4
DRAW EP01120663.8
PCT/LS93/0933X
36/68
AAG TCT AGA CGG CCC AGT GCC AAG AGT ACC ATG CCT ACT AGC CTC CCT Si G
Lys Ser Arg Arg Pro Ser Ala Lys Ser Thr Met Pro lr\r Ser ieu Pre
290 295 300
AAC CTT GCC AAG GAG GCA AAG GAT GCC AAG GGT AGT AGG AGG AAG AAG 958
Asn Leu AIq Lys Glu AIq Lys Asp Ala Lys Gly Ser Arg Arg Lys Lys
305 310 3I5
TCT CTG AGT GAG AAG GTC CAA CTG TCT GAG AGT TCA GTA ACT TTA TCC I0G6
Ser Leu Ser Glu Lys Val Gin Leu Ser Glu Ser Ser VqI Thr Leu Ser
320 325 330 335
CCT GTT GAT TCC CTA GAA TCT CCT CAC ACG TAT GTT TCC GAC ACC ACA ï054
Pro Vûl Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Thr Tyr Vûl Ser Asp Thr Thr
340 345 350
TCC TCT CCA ATG ATT ACA TCC CCT GGG ATC TTA CAG GCC TCA CCC AAC : :C2
Ser Ser Pro Met Ile Thr Ser Pro Gly He Leu Gin AIq Ser Pro Asn
355 360 365
CCT ATG TTG GCC ACT GCC GCC CCT CCT GCC CCA GTC CAT GCC CAG CAT : .*::
Pro Met Leu AIq Thr Ata Ala Pro Pro Ala Pro Val His Ala Gin His
370 375 380

GCA CTA TCT TTT TCT AAC CTT CAT GAA ATG CAG CCT TTG GCA CAT GGG
Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu His Glu Met Gin Pro Leu Ala His Giv
385 390 395
GCC AGC ACT GTG CTT CCC TCA GTG AGC CAG TTG CTA TCC CAC CAC CAC :2<"S
Ala Ser Thr VqI Leu Pro Ser Val Ser Gin Leu Leu Ser His His His
400 405 410 41:
ATT GTG TCT CCA GGC AGT GGC AGT GCT GGA AGC TTG AGT AGG CTC CAT :29<
He Val Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ala Gly Ser Leu Ser Arg Leu His
420 425 430
CCA GTC CCA GTC CCA GCA GAT TGG ATG AAC CGC ATG GAG GTG AAT GAG :342
Pro Val Pro Vol Pro Ala Asp Trp Met Asn Arg Met Glu Val Asn Giu
435 440 445
36
FIG. 11C
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
nR aw EP01120663.8
Printed:17-05-2004 ,?.,_, DRAW
* 37/68
ACC CAG TAC AAT GAG ATG TTT GGT ATG GTC CTG GCT CCA GCT GAG GGC :390
Thr Gin Tyr Asn Glu Met Phe Gly Met VqI Leu Ala Pro Ala Glu Glv
450 455 460
ACC CAT CCT GGC ATA GCT CCC CAG AGC AGG CCA CCT GAA GGG AAG CAC I438
Ihr His Pro Gly He Ala Pro Gin Ser Arg Pro Pro Glu Gly Lys His
465 470 475
ATA ACC ACC CCT CGG GAG CCC TTG CCC CCC ATT GTG ACT TTC CAG CTC I486
He Thr Thr Pro Arg Glu Pro Leu Pro Pro Ile Val Thr Phe Gin Leu
480 485 490 495
ATC CCT AAA GGC AGT ATT GCC CAA CCA GCG GGG GCT CCC CAG CCT CAG 1534
lie Pro Lys Gly Ser He Ala Gin Pro Ala Gly Ala Pro Gin Pro Gin
500 505 510
TCC ACC TGC CCT CCA GCT GTT GCG GGC CCC CTG CCC ACC ATG TAC CAG I5S2
Ser Thr Cys Pro Pro Ala Val AIq Gly Pro Leu Pro Thr Met Tyr Gin
515 520 525
ATT CCA GAA ATG GCC CGT TTG CCC AGT GTG GCT TTC CCC ACT GCC ATG 1630
Ile Pro Glu Met AIq Arg Leu Pro Ser Val Ala Phe Pro Thr Alo Met
530 535 540
ATG CCC CAG CAG GAC GGG CAG GTA GCT CAG ACC ATT CTC CCA GCC TAT i678
Met Pro Gin Gin Asp Gly Gin Vol AIq Gin Thr He Leu Pro AIq Tyr
545 550 555
CAT CCT TTC CCA GCC TCT GTG GGC AAG TAC CCC ACA CCC CCT TCA CAG 1726
His Pro Phe Pro Alo Ser Vai Gly Lys Tyr Pro Thr Pro Pro Ser Gin
560 565 570 575
CAC AGT TAT GCT TCC TCA AAT GCT GCT GAG CGA ACA CCC AGT CAC AGT 1774
His Ser Tyr Ala Ser Ser Asn AIq Ala Glu Arg Thr Pro Ser His Ser
580 585 590
GGT CAC CTC CAG GGT GAG CAT CCC TAC CTG ACA CCA TCC CCA GAG TCT !822
Gly His Leu Gin Gly Glu His Pro Tyr Leu Thr Pro Ser Pro Glu Ser
595 600 605
FIG.11D
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
37
Printed:17-05-2004l/0-4.4 . DRAW EP01120663.8
- 4/0 4 4 PCT/LS93/0933X
?^ 38/68
::r gac cag tgg tca agt tca tca ccc cac tct gct kj gac tgg tca :e7c
Pro Asp Gin Trp Ser Ser Ser Ser Fro His Ser Ala Ser Aso Tro Ser
6I0 6I5 620
GAT GTG ACC ACC AGC CCT ACC CCT GGG GGT GCT GGA GGA GGT CAG CGG ;9I8
Aso Val 1'r.r Tnr Ser Pro Thr Pro Gly Gly Ala Gly Gly Giy Gin Arg
625 630 635
GGA CCT GGG ACA CAC ATG KI GAG CCA CCA CAC AAC AAC ATG CAG GT7 1966
Gly Pro Gly Thr His Met Ser Glu Pro Pro His Asn Asn Met Gin Val
640 645 650 655
TAT GCG TGAGAGAGTC CACCTCCAGT GTAGAGACAT AACTGACTTT TGTAAATGCT 2022
Tyr AIq
GCTGAGGAAC AAATGAAGGT CATCCGGGAG AGAAATGAAG AAATCTCTGG AGCCAGC7TC 2082
TAGAGGTAGG AAAGAGAAGA TGTTCTTATT CAGATAATGC AAGAGAAGCA ATTCGTCAGÏ 2142
TTCACTGGGT ATCTGCAAGG CTTATTGATT ATTCTAATCT AATAAGACAA GTÏTGTGGAA 2202
ATGCAAGATG AATACAAGCC TTGGGTCCAT GTTTACTCTC TTCTATTTGG AGAATAAGAT 2262
GGATGCTTAT ÏGAAGCCCAG ACATTCTTGC AGCTTGGACT GCATTÎTAAG CCCTGCAGGC 2322
TTCTGCCATA TCCATGAGAA GATTCTACAC TAGCGTCCTG TTGGGAATTA TGCCCTGGAA 2382
TTCTGCCTGA ATTGACCTAC GCATCTCCTC CTCCTTGGAC ATTCTTTTGT CTTCATTTGG 2^2
TGCTTTTGGT TTTGCACCTC TCCGTGATTG TAGCCCTACC AGCATGTTAT AGGGCAAGAC 2502
CTTÎGTGCTT TTGATCATTC TGGCCCATGA AAGCAACTTT GGTCTCCTTÎ CCCCTCCTGT 2562
CÎTCCCGGTA TCCCTTGGAG TCTCACAAGG TTTACTTTGG TATGGTTCTC AGCACAAACC 2622
TTTCAAGTAT GÎTGTTTCTT TGGAAAATGG ACATACTGTA TTGTGTTCTC CTGCATATAT 2682
CATTCCTGGA GAGAGAAGGG GAGAAGAATA CTTTTCTTCA ACAAATTTTG GGGGCAGGAG 2742
ATCCCTTCAA GAGGCTGCAC CTTAATTTTT CTTGTCTGTG ÎGCAGGTCTT CATATAAACT 2802
FIG.11E
SUBSTITUTE SHEET(RULE26) 31-08-2001
oo
OR AW EP01120663.8
Printed:17-05-20041/0-4-4 uhhvv pCT/l:>y.«/u9jj><
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TTACCAGGAA GAAGGGTGTG AGTTTGTTGT TTTTCTGTGT ATGGGCCTGG TCAGTGTAAA 2S62
GTTTÎATCCT TGATAGTCTA GTTACTATGA CCCTCCCCAC TTTTTTAAAA CCAGAAAAAG 2922
GTTTGGAATG TTGGAATGAC CAAGAGACAA GTTAACTCGT GCAAGAGCCA GTTACCCACC 2982
CACAGGTCCC CCTACTTCCT GCCAAGCATT CCATTGACTG CCTGTATGGA ACACATTTGT 3042
CCCAGATCTG AGCATTCTAG GCCTGTTTCA CTCACTCACC CAGCATATGA AACTAGTCTT 3102
AACTGTTGAG CCTTTCCTTÎ CATATCCACA GAAGACACTG TCTCAAATGT TGTACCCTTG 3162
CCATTTAGGA CTGAACTTTC CTTAGCCCAA GGGACCCAGT GACAGTTGTC TTCCGTTTGT 3222
CAGATGATCA GTCTCTACTG ATTATCTTGC TGCTTAAAGG CCTGCTCACC AATCTTTCTT 3282
TCACACCGTG TGGÎCCGTGT TACTGGTATA CCCAGTATGT TCÎCACTGAA GACATGGACT 3342
TTATATGTTC AAGTGCAGGA ATTGGAAAGT TGGACTTGTT TTCTATGATC CAAAACAGCC 3402
CTATAAGAAG GTTGGAAAAG GAGGAACTAT ATAGCAGCCT TTGCTATTÎT CTGCTACCAT 3462
TTCTTTTCCT CTGAAGCGGC CATGACATTC CCTTTGGCAA CTAACGTAGA AACTCAACAG 3522
FIG. 11F
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) '31 -08-2001
39
Printed: 17-05-2004
DRAW
94/0-4-4
EP01120663.8
PCT/LS93/0933K
40/68
AACATTTTCC TTTCCTAGAG TCACCTTTTA GATGATAATG GACAACTATA GACTTGCTCA 3582
TTGTTCAGAC TGATTGCCCC TCACCTGAAT CCACTCTCTG TAÏTCATGCT CTTGGCAATT 3642
TCTTTGACTT TCTTTTAAGG GCAGAAGCAT TTTAGTTAAT TGTAGATAAA GAATAGTTTT 3702
CTTCCTCTTC TCCTTGGGCC AGTTAATAAT TGGTCCATGG CTACACTGCA ACTTCCGÎCC 3762
AGTGCTGTGA rGCCCAFGAC ACCTGCAAAA TAAGTTCTGC CTGGGCATTT TGTAGATATT 3822
AACAGGTGAA TTCCCGACTC T7TTGGTTTG AATGACAGTT CTCATTCCTT CTATGGCTGC
Î882
AAGTATGCAT CAGTGCTTCC CACTTACCTG ATTTGTCTGT CGGTGGCCCC ATATGGAAAC 3942
CCTGCGTL7TC TGÎ7GGCATA ATAGTTTACA AATGGTTTTT TCAGTCCTAT CCAAATTTAT 4002
7GAACCAACA AAAATAATTA CTTCTGCCC7 GAGATAAGCA GATTAAGTTT GTTCATÎCTC 4062
TGCTTTATTC TCTCCATGTG GCAACATTCT GTCAGCCTCT TTCATAGTGT GCAAACATTT
4icd
fATCATTCTA AATGGTGACT CTCTGCCCTT GGACCCATTT ATTATTCACA GATGGGGAGA 4162
ACCTATCTGC ATGGACCCTC ACCATCCTCT GTGCAGCACA CACAGTGCAG GGAGCCAGTG ^Z
GCGATGGCGA TGACTHCTr CCCCTG 4268
FIG. 116
40
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
31-08-2001
41/68
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44/68
Site de clivage potentiel de signal -
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---------PL LAPLLCLALL PA-
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hum N MP--------------------------------------
TAN-1 MP?:-------------------------------
Xen N MO--------------------------------------------
Oros N MOSQRSRRRS RAPNTWICTW (NKMHAVASL PASIPILUT IAFANLPNIV RGTDTALVAA
-APA HA-
-LAA RG-
-VIT QC-
hum N MLGKATCRCA SGFTGEDCQY STSHPCFVSR PCLNGCTCrW LSROT-YECT CQVCFTCKEC
ïon-l GVADYACSCA LGFSGPLCLT PLDNAC-LTN r^CRNGGTCOL IT-LTEYKCR CPPGWSCKSC
Xen N NAIOFICHCP VCFTOKVCLT PVDNAC-VNN PCRNGGTCEL LNSVTEYKCR CPPGWTGOSC
Oros N CRFGISCKCP LGFDESLCEI AVPNAC-OHV TCLNCCTCQL KT-LEEYTCA CANGYTGERC
hum N NLPGSYQCCC PQGFTGOYCO SLYVPCAPSP CVNGGICRQT GOFÎFECNCL PGFEGSTCER
TAN-1 NEVGSYRCVC RATHTGPNCE RPYVPCSPSP CQNGGTCRPT GDVTHECACL PGFTGONCEE
Xen N NEFGSYRCTC QNRFTGRNCO EPYVPCNPSP CLNGGTCROT OOTSYOCTCL PGFSGQNCEE
Oros N NTHGSYCCMC PTGYTGKiXO TKYNPCSPSP CQNAGICRSN G-LSYECKCP KCFECKNCEQ
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Répétitions de type EGF
QCROGYEPCV NEGMCVTYHN GTGYCKCPEG FLGEYC*QHRO PCE-KNRCQN GGTC-VAQA 83
RCSQPGETCl NGGKCEA-AN GTEACVCGGA FVGPRCQOPN PCL-STPCKN AGTCHWDRR 80
RCTOTAEMCL ^CGRCEMTPG GTGVClCGNl YFGERCCfPN PCTIKNGCMN FGTCEPVLQG 90
SCTSVG-CQ NGGTCVTaN GKTYCACOSH YVGOYCEHRN PÇN-SMRCQN GGTCQVTFRN 117
CVfTOACLSHP CANGSTCTTV -ANQFSCKC LTGFTGQKCE TOVNEC-OIP GHCQHGGT? 199
COAOPCASM5 CANGGQCLPF -EASYICHC PPSFHGPTCR QOVNECGOKP RLCRHGGTCH 196
COADPCASNP CANGGKaPF -EIQYICKC PPGFHGATCK QOINEC-S-Q NPCKNCSGQCI 195
ETKNLCASSP CRNGATCTAl ACSSSFTCSC PPGFTGOrCS YDIEEC-Q-S NPCKYGGICV 233
NIDDCPNHRC ONGGVCVDGV NTYrCRCPPQ WTGQFCTEDV OECllQPNA- CQNGGTCANR 318
NIOOCPGNNC KNGGACVOGV NTYNCPCPPE "ATGQYCTÊDV OECÛLMPNA- CONGGTCHNT 315
NlOfXPSNNC frMXÎTCVDGV NTYNCQCPPD WTGQYCTEOV OECQLMPNA- CONGGTCHNT 314
NYDOCLGHLC QNGGTCIDGI SOYTCRCPPN FTGRFCCOOV DECAQROHPV CONGATCTNT 352
FIG.13A
Printed: 17-05-2004 0-4-4
DRAW
EP01120663.8
PCT/ L o» j/ uv J3H
45/68
hum N NGGYGCVCVN GWSGOOCSEN lOOCAfASCT PGSTCIORVA SFSCMCPEGK AGLLCHLOOA
TAN-1 HGGYNCVCVN GWTCEDCSEN IDDCASAACF HGATCHORVA SFYCECPHGR TGLLCHLNOA
Xen N YGGYNCVCVN GWTGEOCSEN IO0CANAACH SGATCHORVA SFYCECPHGR TGLLCHLÛNA
Oros N HCSYSCICVN GrVAGLQCSNN TDDCKQAACF YGATCIQCVC SFYCQCTKGK TGLLCHLODA
hum N AFHCECLKGY ACPRCEMDIN ECHSOPCONO ATCLOKICGF TCLOPCFKC VHCEIEINEC
TAN-! SFECOCLCGY TGPRCEIOVN ECVSNPCONO ATCLOOIGEF QCMOUPCYEC VHCEVNTOEC
Xen N SFCCNCPCCY AGPRCEIOVN ECLSNPCQND STCLOOIGEF OCICMPGYEG LYCETNIOEC
Oros N SYRCNCSCGF TGPRCETNIN ECESHPCQNE GSCLDOPGTF RCVCMPGFTG TQCEIDIDEC
hum N ATGFTGVLCE ENIONCOPOP CHHGCCQOG! DSYTC1CNFG YMGAICSOQI DECYSSPCLN
TAN-1 TEGYTGTHCE VDJOECOPOP CHYGSCKDGV ATFTCLCRPG YTGHHCETNI NECSSOPCRL
Xen N TEGFTGRHCE OOINECIPOP CHYGTCKOGI ATFTCLCRPG YTGRLCONDI NECLSKPCLN
Oros N PPGYTGTSCE ININDCOSNP CHKGKCIDDV NSFKCLCOPG YTGYICQKOI NECESNPCCf
-\
y
j
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L
-<
CISNPCHKGA LCOTNPLNGO YICTCPCGYK GADCTEOVDE CAMANSNPCE HAGKCVNTOG
CISNPCNEGS NCOTNPVNGK AICTCPSGYT GPACSQOVDE CSLG-ANPCE HAGKCINTLG
CISNPCNEGS NCOTNPVNGK AICTCPPGYT GPACNNOVDE CSLG-ANPCE HGGRCTNTLG
CTSNPCHADA ICOTSPINCS YACSCATGYK GVDCSEOIOE COQG-SPCE HNGICVNTPG
QSNPCVNNGQ CVOKVNRFGC LCPPGFTGPV COIOIOOCSS TPCLNGAKCI OHPNGYECOC
ASSPCLHNGR CLOKINEFCC ECPTGFTGHL CÛYDVOECAS TPCKNGAKCL OGPNTYTCVC
ASNPCLHNGK CIDKINEFRC DCPTGFSGNL COHOFOECTS TPCKNGAKCL DGPNSYTCOC
QSNPCLNOGT CHDKINGFKC SCALGFTGAR CQ1NI00CQS QPCRNRCICH DSIAGYSCEC
OGRCIDLVNG YCCCQPCTS GVNCEINFOO CASNPCIHG- ICMDGINRYS CVCSPGFTGO
RCTCCOPDNA YLCFCLKGTT GPNCEINLOO CASSPCOSG- TCLOKiOGYE CACEPGYTGS
GGQCTDRENG YICTCPKGTT GVNCETKIOO CASNLCDNG- KCIDKIDGYE CTCEPGYTGK
OGHCOORVGS YYCÛCOAGTS GKNCEVNVNE CHSNPCNNGA TCIOGINSYK CQCVPGFTGQ
4 36
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433
4 70
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673
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A.
FIG.13B
45
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
31-08-2001
?r<nted:17-05-2004 /0-4-4
:0
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TAN- ;
Xs.-i N
Oros N
hun N
FAN-I
Xen N
Oros N
hun N
TAN-1
Xer. N
Gros N
DRAW
EP01120663.8
PCT/LS93/0933K
46/68
RCS'IDIOECA SNPCRKGATC INGVMGFRCI CPEGPHHPSC YSQVNECLSN PCI-HCNCTC
MCNSNIDECA CNPCHNCCTC EDGIiNGFTCR CPECYHOPTC LSEVNECNSN PCV-HGACRO
LCNiNINECO SNPCRNGGTC KOOINGFTCV CPOGYHDHMC LSEVNECNSN PCI-HGACHO
HCEKNVOECI SSPCAMNGVC IDOVNGYKCE CPRGFYDAHC LSOVDECASN PCVNEGRCEO
OECASNPCLN QGTCFOOISG YTCHCVLPYT GKNCOTVLAP CSPNPCENAA VCKESPNFES
NECASNPCLN KGTCIOOVAG YKCNCLLPYT GATCEWLAP CAPSPCRNGG ECRQSEQYES
NECSSNPCLN HGTCIDDVAC YKCNCMLPYT GAICEAVLAP CAGSPCKNGC RCKESEOr"?
OOCVTNPCCN GGTCIDKVNG YKCVCKVPFT GROCESKMDP CASNRCKNEA KCTPSSNFLC
CLANPCONGG SCMOGVNTFS CLCLPGFTGO KCOTONMECL SEPCKNGGTC SOYVNSyFck
CRPNPCHNGG SCTDGINTAF COCLPGFRGT FCEEDINECA SOPCRNGANC TOCVDSY*:"
COPNPCHNGG SCSDGINMFF CNCPAGFRGP KCEEOINECA SNPCXNGANC TDCVNSvrC"
CASFPCONGC TCLOGIGDYS CLCVDGFOGK HCETOINECL SOPCONGATC SOYVNSr:C"
"\
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_/
r
r
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M
CLSGYKCICD AGWVGINCEV OKNECLSNPC ONGGTCONLV NGYRCTCKKG FKCYNCOVN:
SLNGYKCOCO PGWSGTNCOI NNNECE5NPC VNGGTCXDMT SGIVCTCREG.FSGPNCGTN.
GVNGYKCOCE AGWSGSNCDf NNNECESNPC MNGGTCKOMT GAYICTCKAG FSCPNCCTV
GINEFICHCP PGYTGKRCEL DIOECSSNPC QHGGTCYDKL iWSCOCWPG YTGQKCETV
KfrJ
YTCLCA-fGW OGORCTIOIO EC-ISKPCW HGLCHNTOGS YMCECPPGFS GMDCEEDi
FSCVCPTAGA KGOTCEVDIN EC-VLSPCRH GASCONTHGG YRCHCOAGYS GRNCETOIC: 9* '
FSCECP-PGW OGOTCEfOMN EC-VNRPCRN GATCQNTNGS YKCNCKPGYT GRNCEMDJC*: 9:9
FSCTCK-LGY TGRYCOEOID ECSLSSPCRN GASCLNVPGS YRCLCTKGYE GRDCAINTÇD 94=
COAGFOGVHC ENNINECTES SCFNGGTCVD GINSFSCLCP VGFTGSFCLH EINECSSHPC 'Z$<-
CPAGFSGIHC ENNTPDCTES SCFNGGTCVD GINSFTaCP PGFTGSYCQH WNECOSRPC 'Zl'
COPGFSGIHC ESNTPOCTES SCFNGGTCIO GINTFTCOCP PGFTGSYCQH DINECOSKPC :C29
CPLCFSCINC OTNDEOCTES SCLNGGSCIO GINGYNCSCL AGYSGANCOY KLNKCOSNPC 'C59
^
FIG.13C
46
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
31-08-2001
Printed: 17-05-2004 n .
DRAW
EP01120663.8
PCT/LjVj/uvj3x
47/68
hum N LNEGTCVOGL CTYRCSCPLG YTGKNCOTLV NLCSRSPCKN KGTCVOKKAf SOCLCPSGWA
TAN-: LLGGTCQOGR GLHRCTCPCC YTGPNCONLV HWCOSSPCKN GGKCWQTHTO YRCECPSGWi
Xen N' LNGGTCQOSY CTYKCTCPQC YTGLNCQNLV RCOSSPCKN GGKCWQTNNF YRCECKSGWT
Dros N LNGATCHEQN NEYTCHCPSG FTCKQCSEYV OCGQSPCEN GATCSQMKHQ FSCKCSAGWT
humN SNPCOHGATC SDFJGGYRCE CVPGYGGVNC EYEVDECQNO PCONGGTCIO LVNHFKCSC?
TAN-: PSPCONGATC TOYLGGYSCK CVAGYHGVNC SEEIOECLSH PCQNGGTCLD LPNTYKCSC?
Xen N PNPCONGATC TOYLGGYSCE CVAGYHGVNC SEEINECLSH PCONGGTCIO LINTYKCSC?
Oros N SOPCONGGTC ROLIGAYECO CRCGFQGONC ELNIOOCAPN PCONGGTCHD RVMNFSCSC?
hum N
TAN-I
Xen N
Dros N
CLSNPCSSEG SLDCIOLTNO YLCVCRSAFT GRHCETFVDV CPfJMPCLNGG TCAVASNMPO
CLSNPCOARG TONCVQRVNO FHCECRAGHT GRRCESVING CKGKPCKNGG TCAVASNTAR
CLSNPCOSRG TONCIQLVNO YRCECROGFT GRRCESWDG CKGMPCRNGG TCAVASNTER
CLSNPCSNAG TLDCVOLVNN YHCNCRPGHM GRHCEHKVOF CAQSPCQNSC NCNI?ROS
^
>"
J
<
(^GAYCOVPNVS COIAASRRGV LVEHLCQHSG VCINAGNTHY CCCPLGYTGS YCEEQLOECA ;:54
GLYCOVPSVS CEVAAOROGV OVARLCOHGG LCVDAGNTHH CRCOAGYTGS YCEOLVOECS M5I
GVYCOVPSVS CEVAAKQCGV OIVHLCRNSG MCVDTGNTHF CRCOAGYTGS YCEEOVOECS 1149
GKLCOVQTIS CQOAAORKGL SLRaC-NNG TCKDYGNSHV CYCSQGYAGS YCQKEIOECQ 1188
PGTRGLLCEE NIOOCAR----------------GPHCLN GGCOORIGG YSCRaPGFA GERCEGOINE 1267
RGTCCVHCEI WTJOCNPPVD PVSRSPKCFN NGTCVDOVGG YSCTCPPGFV GERCEGOVNE 1271
RGTCGVHCEI NVDDCTPFYD SFTLEPKCFN NGKCIORVGG YNCICPPGFV GERCEGOVNE 1269
PCTMG1ICE1 WDOCXP------------------GACHN NGSCIORVGG FECVCOPGFV GARCEGOINE 1300
GFICRCPPGF 9GARC0S? SCGQVKCRKG ECCVHTAS? GPRCFCPSP- -ROCES? 1376
GFICKCPAGF EGATCENOAR TCGSLRCLNG GTCISGPR- SPTCLCLGPF TGPECQFPAS 1389
GFICKCPPGF OGATCEYDSR TCSNLRCONG GTCISVLT- SSKCVCSEGY TGATCOYPVl '387
yGHHClCNNGF YGKNCELSGQ DCDSNPCRVG -NCWADEGF GYRCECPRGT LCEHCEIDU 1415
FIG. 13D
47
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
31-08-2001
48/68
r.um N -GC-ASSPCO HGGSCHPQRQ PPYYSCQCAP PFSGSRCEL- -YTAPP------------S----------TPP
TAN-; S°CLGGNPCY NGGTCEPTSE SPFYRCLCPA KFNGLLCHIL OYSFGG------------GAGROIPP?
Xen N SPC-ASHPCY NGGTCOFFAE EPFFOCFCPK NFNGLFCH1L OYEFPG------------GLGKNITPP
Oros N QEC-SPNPCA GGAACEDLLG O-YECLCPS KWKGKRCOIY OANYPGWNGG SGSGNORYAA
numN NN-QCDELCN TVECLFONFE CQGNSKTCK- -YOKYCADHF KONHCNCGCN SEECGWDGLO
TAN-1 SOGHCOSCCN SAGCLFDGFO CORAEGGCNP LYOOYCKOHF SOGHCOCGCN SAECEWOGLO
Xen N NOGKCDSQCN NTGCLYOGFO COKVEVQCNP LYOOYCKOHF QIXHCOQGCN NAECEWDGLD
Oros N KNGKCNEECN NAACHYOGHO CERKLKSCOS LFDAYCQKHY GOGFCOYGCN NAECSWOGLO
hum N YYGEKSAAMK KO-R-----------------------------------------MTRRSL PGEQ----------E QEVAGSKVFL
7AN-1 YYGREEELRK HPIKRAAEGW AAPOALLGQV KASLLPGGSE GGRRRRELDP MDVRGSIVYL
Xen N YYGNEEELKK HHIKRSTOYW SDAPSAl----------FSTMKESIL LGRHRRELOE MEVRGSIVYL
Dros N WKDNVRVPEI EOTOFARKNK ILYTQOVHQ------------------------------------------------------TGIOIYL
"*N
>?
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J
LNR (Répétitions Notch/Lin-12)
-<
f?A?TCL SOYCAOKARO GVCOEACNSH ACXMJGGDCS LTMENPWANC SSPLPCWDYI 14 76
i LIEE?ACE LPECQEDACN KVCSLOCNNH ACGWDGGOCS LNFNOPWKNC TQSLCOKYF !50!
ONOO?ICE NEfXSELADN KVCNANCNNH ACGWDGCOCS LNFNOPWKNC TffiLQCWKYF 1498
OLECQRAICO KRCCTEKOCN GICOSOCNTY ACNFOGNKS LCI-flPWANÇ TAN-EXWNKF 1531
CÂADQPEN-L AEGTLVIWL MPPEQLLQOA R-SFLRALGT LLHTNLRIKR OSCCELMVYP 1591
CAEHVPER-L AAGTL-VWV LMPPEQLRNS SFHFLRELSR VLHTNWFKR OAHGOQMIFP 1619
C-iANMPEN-l AEGTLVLWl fcPPERLKNNS V-flFLRELSR VLHTNWFKK OSKGEYKIYP 1615
CENKTOSPVL AEGAMSWML MNVEAFREIQ A-QFlRNMSH MLRTTVRLKK OALGHOIIIN 1650
_E_t
EIDNRQCVOO SOHCFKNTDA AAALLASHAI OG?TLSYP LVSWSESLT PERHRLY 1680
EIDNRQCVOA SSQCFQSATD VAAFLGALAS LGSL-NIPYK IEAVQSETVE PPPPAtHHF 1737
EIONROCYKS SSQCFNSATO VAAFLGALAS LGSLOTLSYK IEAVKSENME TPKPSKYP 1730
^EIONRKCTEC FTHAVEAAEF LAATAAKHQL RNDFQ-IHSV RGIKNPGOEO NGEPPANVKY 1745
FIG.13E
49/68
num N L-.AVAWIk FIILLGVIMA KRKRK-HGS LWLPEGFTLR ROASNHKRRE PVGCOAVGLK
TAN-1 MYVAAAAFVL LFFVGCGVLL SRKRRRQHGQ LWFPECFKV- SEASKKKRRE ELGEOSVCLK
Xen N MLSMLVIPLL IIFVFMMVIV NKKRRREHOS FGSPTALFOK NPA-KRNGET PW-EDSVGLK
Oros N ViTGIILVII ALAFFGMVL- STQRKRAHGV TWFPEGFRAP AAVMSRRRRO PHGOEMRNLN
Répétitions CDC-10/ankyrine
>
hum N PSORRPWrOQ HLEAAOIRRT PSLALTPPOA EOEVOVLOVN VRGPDGCTPL MLASLRGGSS
TAN-1 OTOHROWTCO HLDAADL-RM SAMAPTPPGG EVDAOOOVN VRGPOGFTPL MIASCSGGGL S
Xen N KTOPROrYTRQ HLOAAOL-RI SSMAPTPPQG EIEAOOOVN VRGPOGFFL MIASCSGGGL
Oros N EAOQRVWSOA HLOWDV-R- AIM?TPP-A HQOGGKHDVD ARGPCGLTPL MIAAVRGGGL
hum N ANAOONM3RC PLHAAVAAOA QGVFQILIRN RVTOLOARMN DGTTPLlLAA RLAVEGMVAE
TAN-1 ANIQONMGRT PLHAAVSADA QGVFQILIRN RATDLDARMH DGTTPLlLAA RLAVEGMLEO
Xen N ANVQONMCRÎ PLHAAVAAOA QGVFQILIRN RATOLOARMF OGTTPLILAA RLAVEGMVEE
Dros N ANCQQNTGRT PLHAAVAAOA MGVFQILLRN RATNLNARMH OGTTPLILAA RLAIECMVEO j
r
-<
^NLSVQVSEAN LIGTGTSEHW VOOE--------------------------------G PQPKKVKAEO EALLSE-EOO 1782
PLK-NASOGA LMOONONE-W GOEO----------------------------------LETKKFRFEE PWLPO-L00 1837
P1K-NMTOGS FMDDNQNE-W GOEET--------------------------------LENKRFRFEE QVILPELVOO 1831
KOVAMQSQGV GQPGAH?W SOOESOMPLP KRQRSOPVSG VGLGNNGGYA SOHÎMVSEYE 1861
OLSOEOEOAE OSSANIITOL VYCGASLQAQ TORTGEMALH LAARYSRAOA AKRLLOAGAO 1902
ETGNSEÊE-E DAPA-VISOF IYQGASLHNQ TDRTGETALH LAARYSRSOA AKRLLEASAD 1954
ETGNSEEE-E OASANMISOF IGCGAQLHNQ TDRTGETALH LAARYARAOA AKRLLESSAO 1949
DTGE01ENNE DSTAQVISOL LAQCAELNAT MDKTCETSLH LAARFARAOA AKRLLOAGAO 1976
LINCQAOVNA VDDHGKSALH WAAAVNNVEA TLLLIKNGAN WH30NKEET PLFLAAREGS 2022
LINSHAOVNA VDOLGKSALH WAAAVNNVDA AWLLKNGAN KOMQNNREET PLFLAAREGS 2074
LINAHAOVNA VDEFGKSALH WAAAVNNVDA AAVLLKNSAN KTJMQNNKEET SLFLAAREGS 2069
LITADADINA AONSGKTALH WAAAVNNTEA VNILLMHHAN ROAQOOKOET PLFLAAREGS 2096
^
FIG.13F
Printed: 17-05-2004 0--1T4
rum N
;an-i
Xen N
Oros N
num N
TAN-1
Xen N
Oros N
DRAW
EP01120663.8
Pv. I/L, u' ji \jyjjn
50/68
">
YEAAXILLDH FANROITOHM DRLPROVARO RMHHOIVRLL OEYNVTPSPP ?GTVL?TS
YETAKVLLOH FANROITOHM DRLPROIAOE RMHHOIVRLL DEYNLVRSPQ LHCAPLCGT?
YETAKVLLOH YANRDITDHM DRLPROIAOE RMHHOIVHLL OEYNLVKSPT LHNGPLGAi-
YEACKALLON FANREITOKM ORLPROVASE RLHHOIVRLL OE-HVPRSPO MLSMTPQAMI
NLS
CK
cdc2
cdc2
GSRRKKSLSE KVQLSE-SS VTLSPVDSLE SPHTYVSOTT SSPM-
A-RRKKSQOG KGCLLO-SS GML5PV0SLE SPHGYLSOVA SPPL-
A-RRKKSQOG KTTLLDSGSS GVLSPVDSLE STHGYLSDVS SPPL-
: y
GS-PDNGLOA TGSLRRKASS KKTSAASKKA ANLNGLNPGO LTGGVSGVPG VPPTNSAAQA
8NTS
num N
TAN-1
Xen N
Oros N
ITSPGILQAS PNPML?ATA APPAPVHAQH
LPSPF?QOS PSVPLNHLPG MPOTHLGIGH
MTSPF-QQS PSMPLNHLTS MPESQLGMNH
^EOCIKNAOS MQSLQGNGLD MIKLONYAYS MGSPF?QQE LLNGQGLGMN GNGQRNGVGP
CK I! cdc2 J
r
L
--<
ALSPV-
TLSPP-
TLSPP-
-ICGP NRSFLSLKHT PMGKKSRRPS AKSTMPTSLP NLAKEAKDAK
-LCSP NGYLGSLKPG VfXKKVRKPS SKGLACGS------------KEAKDLK
-ICSP N3YMGNMKPS VQSKKARKPS IKGNGC--------------KEAKELK
GSPPPGCCOP QLITQPTVIS AGNGGNNGNG NASGKQSNQT AKQKAA---------------KKAKLIE
AAAAAAAVAA MSHELEGSPV GVGMGGNLPS PYOTSSMYSN AMAAPLANGN PNTGAKOPPS
ALSFSNLHEM 0------------------------------------------PLAHGASTV LPSVSQLLSH HHIVSPGS?
LNVAA-KPEM AALGGGGRLA FETGPPRLSH LPVASGTSTV LGSSSGGALN FTVGGSTSLN
INWAT-KGEM AA-GSNRMA FDAMVPRLTH L-NASSPNTI MS?NGSMH FTVGGAPTMN
GVLPGGLCGM CCLSGAGNGN SHECGLSPPY SNQSPPHSVQ SSLALSPHAY LGSPSPAKSR
2*27
2*75
i /?
22:=
*\ « i» -»
22 -9
22*3
2327
2235
2305
229'
2445
V
FIG.13G
50
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
31-08-2001
51/68
num N CSAGSLSRLH PVPVPAOW- MNRMEVNETQ YNEMFGMVLA PAEG-THPGI APQSRPPEGK
TAN-1 GOCEWLSRLQ SGMVPNOYNP LRGSVAPGPL STQAPSLQHG -MVGPLHSSL AASALSCMMS
Xen N SOCOWLARLQ NGMVQNQYOP IRNGfCOGN- AQOAOALQHG LMTS-LHNGL PATTLSCAMT
Oros N PSLPTSPTHI QAWRHATQOK QFCGSNLNSL LGGANGGGW GGGGGGGGGV COGPONSPVS
>
num N
TAN-1
Xen N
Oros N
hum N
TAN-1
Xen N
Oros N
APOPQSTCPP AVACPLPTMY QIP----------EM ARL-PSVAFP TAMPQQDGQ VAOTILPAYH j
PPOPHLGVSS AASGHLGRSF LSGEPSQAOV QPLGPSSLAV HTILPQ-ESP ALPTSLPSSL L
MQQQHHN-SS TTSTHINSPF CSSOJSQTOL CQM?SSNNI HSVMPQ-OTÛ IFAASLPSNL
OCQLGGLEFG SAGLOLNG-F CGSPDSFHSG QMNPPS?I OSSMSG-SSP STNMLSPSSO :
SDWSOVTTSP TPGGAGGGQR GPGTHMSEPPHNN MQVYA
SDWSEGVSSP PT----------SMQ SQIARIPEAFK
SDWSEGISSP PT----------SMQ PQRTHIPEAFK
SOWSEGVQSP AANNLYISGG HQANKGSEAIYI
y
r
r
L
-A
ITTPRE PLPP-IV-TF OllPKGSIAQ PAG-
-YQGLPSTRL ATQPHLVQTQ QV(HJNLQMQ ÛQNLQPANIQ QQQSLQPP5-"
-YQAMPNTRL ANQPHLMQAQ OMTJOOON?
-LOLHOS
LGUSPTGSO MGIMLAPPQS SKNSAIMQTf SPQQQQQQQQ QQQ(HHQQQQ CQQCQCXXXC
Région contenant PEST
PFPASVGKYP TPPSQHSYAS SNAAERTPSH SGHLCGEHPY LTPSPESPOQ WSSSSPHS.A-
VPPVTAAQFL TPPSQHSY-S S-PVENTPSH QLQVP-EGPF LTPSPESPOQ WSSSSPHSNv
TQSMTTAQFL TPPSQHSY-S S-PMDNTPSH aQVP-OHPF LTPSPESPOQ WSSSSPHSNM
HNCQAFYQYl TPSSGHS-------------GGHTPQH LVQTH)~SY PTPSPESPGH WSSSSPRS.V
~,L' L
V
2cO,
257'
2555
2:23
27C3
FIG.13H
Printed: 17-05-2004
A ' WO 94/07474
DRAW
52/68
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PCT/I.S93/093J8





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*-*hPvS * i >9äL cßs ? »? *?*
FI6.14
52
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31-08-2001
Printed: 17-05-2004
W WC) 94/(17474
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PO/US93/09338
53/68
^f ? \'. %>:^^' ^ .--^ iÉ-V
FIG. 15A
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31-08-2001
Printed: 17-05-2004
DRAW
vvw v4/074~4
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^171*93/09338
54/68
FIG.15B
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SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
31-08-2001
Printed: 17-05-2004
' WO 94/07474
DRAW
EP01120663.8
PCr/i;S93/09338
55/68
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P ' /, f' ' v ?
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FI6.16A
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31-08-2001
Printed: 17-05-2004
A WO 94/07474
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31-08-2001
DRAW EP01120663.8
Printed:17-05-2004 DRAW
UO 94/07474 PCÏ7LS93/0933X
57/68
IC 20 30 40 50 60 70 60 9C
ii« i « « ? i >
GCAATTCCGC CCCCCCTGCC CCCCCCTCTG CTCTGGCCGC TCCTCGCGCf CTCCCTCTCC TGGGCCGCCC CCGCGCAfCC ATTGCAGTCT
PALRPAL IWA LLAL WlC CAA PAHA LCC>
lOO HO 120 »30 140 150 160 170 I80
? ?? « i ? ? i ?
CGACAÎGCCT ATGAACCCTG TGTAAATGAA GGAATGTGÎG TTACCTACCA CAATGGCACA GGATACTGCA AATGTCCAGA AGGCTTCTTC
RDG YEPC VNE CMC VTYH N G T CYC KCPE GfL>
190 200 210 220 230 240 250 260 270
« ? t i.t * $ « *
CCGGAATATT GTCAACAÎCG ACACCCCTGT GACAACAACC GCTGCCAGAA TGGTGGGACT TGTGTGGCCC AGGCCATCCT CGGCAAAGCC
CEY CQHR OPC EKN RCQN GGT C V A OAML GKA>
280 290 300 310 320 330 340 350 360
i<i * ? « « i i
ACCTGCCGAT GTGCCTCAGG CTTTACAGGA GAGGACTGCC AGTACTCAAC ATCTCATCCA TCCTTTGTGT CTOGACCCTG CCTGAATGGC
TCR CASG FTG EDC QYST SHP CFV SRPC LNG>
370 380 390 400 410 420 430 440 450
GGI
CACATCCC ATATGCTCAG CCGGGAÎACC TAÏGAGTGCA CCTGTCAAGT CGGGTTTACA GGTAAGGAGT GCCAATGGAC CGAÏGCCIGC
CTC HMLSROT YEC TCOVGFT GKE CQWT OAO
460 470 480 490 500 510 520 530 540
i t <«???? a
CTCTCTCATC CCTCTGCAAA TCGAAGIACC TGTACCACTG TGGCCAACCA GTTCTCCTGC AAATGCCTCA CAGGCTTCAC AGGGCACAAA
:SH PCAN GST CTT VANQ fSC KCL TGFT GQK>
550 560 570 580 590 600 610 620 630
> ? t « « < ? ? ?
TGTCAGACTG ATGTCAATGA GTGTGACATÎ CCAGGACACT GCCAGCATGG TGGCACCTCC CTCAACCTGC CTGGTTCCTA CCAGTGCCAG
CET OVNE COI PGH COHC CTC LNL PGSY QC0>
640 650 660 670 680 690 700 710 720
? i i t t « ? ? ?
TCCCCrCAGC CCTTCACACC CCAGTACTGT GACAGCCTCT ATGTGCCCTG TGCACCCTCA CCTTCTGTCA ATGGAGGCAC CTGTCGGCAG
CPO CFTC OYC OSL YVPC APS PCV N G G i CR0>
730 740 750 760 770 780 790 800 810
ACTGGTGACT TCACTTTTGA GTGCAACTGC CTTCCAGGTT TTGAAGGGAG CACCTGTGAG AGGAATATTC ATGACTCCCC TAACCACAGG
: G C F ; f : C N C LPG *" ; G S ï C : R N' I 0 D C ? N - R>
FIG. 17 A 31-08-2001
57
Printed: 17-05-2004 DRAW EP01120663.8
m
WO 94/07474 PCT/LS93/0933X .
58/68
820 830 840 850 860 870 880 890 CGC
? ????«??i
TCTCACAATG GACGGGTTTG TGTGGATGCG CÎCAACACTT ACAACTGCCC CTGTCCCCa CAAÎGGACAG GACACTTCTG CACAGAGCAT
CON GGVC VOC V N J Y N C R CPP OWÎ GOFC : E 0>
910 920 930 940 950 960 970 980 990
? ii««« « ? «
CIGGATCAAT CCCTGCTCCA CfXCAATCCC TGTCAAAATG GGGGCACCTG TGCCAACCCC AATGGAGGCT ATGGCTGTGT ATCÎGTCAAC
V 0 E CLLO P N A CON GGTC A N R NGG YGCV C V N>
1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080
? « « « ? « ? ? «
CGCTGGAGTG GAGATCACTC CAGTGAGAAC ATTGATGATT GTGCCTTCGC CÎCCTGTACT CtAGGCTCCA CCTGCATCGA CCGTGTGGCC
CWS GOOC SEN IDD CAFA SCT PCS TCID RVA>
1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170
« «!««? « « «
ÎCCTTCTCÎT GCATCÎGCCC AGAGGGGAAG GCAGGTCTCC TGTCÎCAÎCT GGATGAÎGCA TGCATCAGCA ATCCTTGCCA OWXGGCCA
S F S CMCP ECK AGL LCHL DOA CIS NPCH KCA>
1180 1190 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260
« « « » » t i««
CTGTGTGACA CCAACCCCCT AAATGGGCAA ÏATAÎTTGCA CCTGCCCACA AGGCTACAAA GGGGCTGACT GCACAGAAGA TGTGGATGAA
ICO ÏNPL NGO YIC TCPO GYK GAD CTEO VDE>
1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350
? ?«??? « « «
TCTGCCATGG CCAATAGCAA TCCTTGTGAG aTGCAGCAA AATGTGTGAA CACGGATGGC GCCTTCCACT GTGAGTGTCT CAAGGGTTAÎ
CAM ANSN PCE HAG KCVN TDG AFH C E C L KGY>
1360 i37û 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440
« «?»?t**«
CCAGGACCTC GTTGÎGAGAT GGACAÎCAAT GAGTGCCATT CAGACCCCÏC CCAGAATGAT GCTACCTGTC TGGATAAGAT TGGAGGCTTC
AGP RCEM OIN ECH SOPC Q N D ATC LOKI GGF>
1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530
? ? i ? ? i ? ? i
ACATCTCTCT GCATGCCAGG TTTCAAAGCT GTGCATÎGTG AATTAGAAAT AAAÎGAATGT CAGAGCAACC CTTGTGTGAA CAATGGGCAC
TCL CMPC FKC VHC ELEI NEC QSN PCVN NC0>
1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 1620
« « ? « « « « « t
TGTGTGGATA AAGTCAATCC TTÎCCAGTCC CTGTGTCCTC CTGGTTTCAC TGGGCCAGTÎ TGCCAGATTG ATATTGATGA CTCTTCCAGÎ
CVO KVNR FOC L C P PCFT GPV COI OIDO CSS>
58 Mb. | /D 31-08-2001
DRAW EP01120663.8
Printed: 17-05-2004/0-4-4 unMV PCT/LS9j/0933x
.0 59/68
i630 ÎÔ40 1650 i660 1670 1680 1690 !7C: 7:c
? ? ? i ? i » ? ,
ACrCCGTCTC TCAATCGGGC AAAGTCTAfC CATCACCCCA AfGCCTATCA ATCCCACTCT GCCACACGTT TCACTCCTC: CTTCTCrCAC
r ? C L N G A KCl 0 H ? N C Y E COC ATG F î C V L C £>
'720 '730 1740 I750 ï 760 I770 1780 1790 :800
? «??????«
GAGAACATTG ACAACTCTGA CCCCGATCCT TCCCACCAfC CTCAGTCTCA CGATGGTATT GATTCCTACA CCTGCATCTG CAATCCCGGG
EN! ONCO POP CHHGOCO OGI OSY ÎCIC N P G>
18I0 I820 1830 1840 1850 1860 1870 1880 1390
? ???«*«??
TACATGCGCG CCATCTGCAG TCACCAGATT GATGAATGTT ACACCAGCCC TTGCCTGAAC GATGGTCGCT GCATTCACC? GCTCAATGCC
YMG AICS 001 DEC YSSP CLN 0 G R C i 0 L VNG>
1900 1910 1920 1930 1940 1950 I960 1970 1980
? !???<??«
TACCAGTGCA ACTGCCACCC ACCCACCTCA GGGGTTAATT GTGAAATTAA TTTTGATGAC TGTGCAAGTA ACCCTTGTAT CCATGGAATC
YQC NCOP GTS GVNCEIN FDO CAS N P C : H C l>
1990 2000 2010 2020 2030 2040 2050 2O60 2070
? t » ? $ » » » »
TGTATGGATG GCATTAATCG CTACAGTTGT GTCTGCTCAC CAGGATTCAC AGGGCAGAGA TGTAACATTG ACATTGATGA GTGTGCCTCC
CMO GINR YSC VCSPCFT GOR CNI 0 10: CAS>
2080 2090 2100 2110 2120 2130 2140 - 2150 2160
«««»?«? »?
AATCCCTGTC CCAACCGTGC AACATGTATC AACGGTGTCA ATCGTTTCCG CTGTATATGC CCCGAGGGAC CCCATCACCC CACCIGCTAC
NPC RKGA TCI N G V N G F R CIC PEG P H H = SCY>
2170 2180 2190 2200 2210 2220 2230 2240 2250
«??!?»?«?
TCACAGGTGA ACGAATGCCT GAGCAATCCC TCCATCCATG CAAACTGTAC TGGAGGTCTC AGÎGGATATA AGTGTCTCTG TGATGCAGGC
SOV NECL S N P C IH CNCT GGL SCY KCLC DAC>
2260 2270 2280 2290 2300 2310 2320 2330 .2340
? ????? » ?«
TGGGTTGGCA TCAACTGTGA ACTGGACAAA AATGAATGCC TTTCGAATCC ATGCCAGAAT GGAGGAACTT GTGACAATCT GGTGAATGGA
WVC INCE VOK NEC LSNP CON GGT C D N L VNC>
2350 2360 2370 2380 2390 2400 2410 2420 2430
? ? « ? ? » « t ?
TACAGGTGTA CTTGCAAGAA CGGCTTTAAA GGCTATAACT CCCAGGTGAA TATTGATGAA TGTCCCTCAA ATCCATGCCT GAACCAAGGA
v .** C T C .< F G F K GYN C 0 V N ! 0 E CAS NPC- N C C>
FIG.17C
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
59
Printed:17-05-20040-4-4 DRAW PCT/l*?}***3'*
.? 60/68
2440 2450 2460 2470 2480 2490 2500 - 25iC " 252C
Accrccrnc aigacataag tcgctacact tcccactctc tcctgccata cacacccaac aattctcaca cac'attcgc rcccrcrr
f C r 0 0 ; S G Y T C H C V L P Y T G K N C 0 T V L A ? C S>
/v»
V.L-
2530 2540 2550 2560 2570 2580 2590 2600 25 !C
? ? »ii « « i ,
CCAAACCCTT GTCAGAATGC TCCTGTTTCC AAACACTCAC CAAATTTTCA CACTTATACT ICCTTGTGTG CTCCICGCTC CCAAGGTCAG
PNP CENA AVC KES PNFE SYT CLC A P C W 0 C 0>
2620 2530 2640 2650 2660 2670 2680 2690 2700
? t ? ? » ? » » «
CGCTCTACCA TTCACATTGA CCAGTGTATC TCCAAGCCCT GCATCAACCA TGGTCTCTGC CATAACACCC AGGGCAGCTA CATCÏCTGAA
RCÎ IDIO ECI SKP CMNH GLC HNT OGSY M C c>
2710 2720 2730 2740 2750 2760 2770 2780 2790
? « t ? * « » t i
TCTCCACCAG CCTTCAGTGG TATGGACTGT GAGGAGGACA TTCATGACTG CCTTGCCAAT CCTTGCCAGA ATGGAGGTTC C'CTATCCA'
CPP CFSG MOC EEO IDOC LAN PCO NGCS CMC)
2800 2810 2820 2830 2840 2850 2860 2870 2880
»« » « * «iii
CGACrCAATA CTTTCTCCTG CCTCTGCCTT CCCGGTTTCA CTGGGGATAA GTGCCAGACA GACATGAATG ACTGTCTGAG TGAACCC'C*
CH TFSC LCL PGF T G 0 K CQT OMN ECLS t ; O
2890 2900 2910 2920 2930 2940 2950 - 2960 2970
? ? ? ? « » » « <
AACAAÎGGAG GGACCTGCTC TCACTACGTC AACAGTTACA CTTGCAAGTG CCAGGCAGGA TTTGATGGAG TCCATTGTGA GAACAACa::
K N G CTCS OYV NSY T C K C QAG FOG VHCE N N >
2980 2990 3000 3010 3020 3030 3040 3050 J06C
? « « ? * ?"* ? ?
AATCAGTCCA CTCAGAGCTC CTCTTTCAAT GGTGGCACAT GTGTTGATGG GATÎAACTCC TTCTCTTCCT TGTCCCCTCT GOG^CâT'
NEC TESS CFN GGT CVOG INS ESC LCPV C-'*>
3070 3080 3090 3100 3110 3120 3130 3140 3:50
? ??«?????
CCAfCCrrCT ccctccatga catcaatgaa TGCAGCTCTC ATCCATGCCT GAATGAGCGA ACGTGTGTTG ATGGCCTGGG TACCTACCGC
CSF CLHE INE CSS HPCL NEG TCV OGLC J r R>
3160 3170 3180 3190 3200 3210 3220 3230 324Q
? t ? » ? *?(?
TCCACCTGCC CCCTGGGCTA CACÎGGGAAA AACTGTCAGA CCCTGCTGAA TCTCTGCAGT CCGICTCCAT GTAAAAACAA AGGTACrrc:
C 5 C .= L C Y T G K NCO T L V N L C S R S ? C K N K G ' C>
FIG. 17D
60
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 3J-08-2001
Printed:17-05-2004:4-4 DRAW pcr/LSEP011^0663.8
M 61/68
3250 3260 3270 3280 3290 3300 3310 3320 Uli
? ??????? ,
CTTCACAAAA AAGCAGAGTC CCAGTGCCTA TGTCCATCTG CATCGCCÏCC TCCCTATTCT GACGTCCCCA ATCICICTTC TGACATACCA
V C K KAES OCL CPS CWAG AYC OVP NVSC OiA>
3340 3350 3360 3370 3380 3390 3400 3410 342C
? ? i i ? ? i « ,
CCCTCCAGCA CAGGTGTGCT TCTTGAACAC TTGTGCCAGC ACTCAGCÎCT CTGCATCAAT CCTGGCAACA CCCATTACTC TCAGTCCCCC
ASR RGVL VEH LCQ HSGV CIN ACN THYC QCP>
3430 3440 3450 3460 3470 3480 3490 3500 35IC
? ? ? ? ? « « ? i
CTGGGCÎATA CTGGGAGCTA CTGTGAGGAG CAACTCCATG AGTGTCCGTC CAACCCCTGC CAGCACGGGG CAACATGCAG TCACTTCATÎ
LGY TGSY CEE OLD ECAS NPC OHC ATCS Of i)
3520 3530 3540 3550 3560 3570 3580 3590 3600
»«???»? t »
GGTGGATACA GATCCGAGTG TGTCCCAGGC TATCAGGGTG TCAACTGTGA GTATGAAGTG GATGAGÎGCC AGAATCAGCC CTGCCAGAA-
CGY RCECVPG YQG VNCE YEV DEC ONQP C O N>
3610 3620 3630 3640 3650 3660 3670 3680 3690
? «??««?? ?
GGAGGCACCT GTATTCACCT TGTGAACCAT TTCAAGTCCT CTTGCCCACC AGGCACTCGG GGCCTACTCT GTGAAGAGAA Ca;tga:gaC
GGT CIDL VNH FKC SCPP GTR GLL CEEN :::>
3700 3710 3720 3730 3740 3750 3760 " 3770 375C
? ? ? ? « ? ? « ?
TGTGCCCGGG GTCCCCATTG CCTÏAATGGT GGTCAGTGCA TGGAÎAGGAT TGGAGGCTAC AGTTGTCGCT CCTTGCCIGC Z:"ZZ'ZZZ
CAR CPHC LNG GOC MORI CGY SCR CLP G '? - Z>
3790 3800 3810 3820 3830 3840 3850 3860 387:
? «??*?«? ?
GAGCGTTGTG AGGGAGACAT CAACGAGTCC CTCTCCAACC ?TGCAGCïC TGAGGGCAGC CÏGGACTGTA TACAGCTCAC CAAïCAC'AC
ERC EGOI NEC LSN PCSS EGS LOC IQLT N : v>
3880 3890 3900 3910 3920 3930 3940 3950 3960
? ???«?(» ?
CTGTGTCTTT GCCCTAGTCC CTTTACTGGC CCGCACTGTG AAACCTTCGT CGATGTGTGT CCCCAGATGC CCTGCCTGAA TCGAGGGAC-
LCV CRSA FTG RHC ETFV OVC PQM PCLN CC :>
3970 3980 3990 4000 4010 4020 4030 4040 «C5:
«?«« ? « « ? ?
TGTGCTGTGG CCAGTAACAÎ CCCTGATGGÏ TTCATTTCCC GTTGTCCCCC GGGATTTÎCC GGGGCAAGGT GCCAGAGCAG CTGTGGACV
CAV ASNM POG FIC RCPP GFS CAR COSS Z Z \.-
FIG.17E
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
61
31-08-2001
Printed:17-05-2004>-4-4 DRAW PCT/L??6638
0 62/68
4060 4070 4080 4090 4100 4110 4120 -4130 iuq
? « « i ? « < « ,
GTGAAATGTA CGAAGCCGCA CCAGTGTCTG CACACCCCCT CTCGACCCCC CTCCTTCTGC CCCACTCCCC GGGACTGCGA CTCAGCCTCT
V K C R K G E CCV HTa SCPR C F C PSP ROC E SCO
4150 4160 4170 4180 4190 4200 4210 4220 4230
? i ? i ? i ? t ?
GCCAGTAGCC CCTGCCAGCA CTXGGGCAGC TCCCACCCTC AGCGCCAGCC TCCTTATTAC TCCTCCCACT CTCCCCCACC ATTCTCCGGT
ASS PCÛH CGS CHP ORQP PYY SCO CAPP F S O
4240 4250 4260 4270 4280 4290 4300 4310 4320
? ? i ? ? ? i « >
AGCCCCIGTC AACTCTACAC CGCACCCCCC AGCACCCCTC CTCCCACCTC TCTGAGCCAG TATTGTCCCG ACAAAGCTCC CGATCCCGTC
SRC ELYT APP STP PATC LSO YCA DKAR 0CV>
4330 4340 4350 4360 4370 4380 4390 4400 4410
? « ? « t » ? ??
TGTGATGAGC CCTCCAACAC CCATGCCTCC CACTGGGATG GGGGTGACÎG TTCÎCTCACC ATGGACAACC CCTGGGCCAA CTGCTCCTCC
COE ACNS HAC 0 W 0 GGDC SLT MEN PWAN CSS>
4420 4430 4440 4450 4460 4470 4480 4490 4500
? ««?«*???
CCACTTCCCT GCTCGGATTA TATCAACAAC CAGTGTGATG AGCTGTGCAA CACGGTCGAG TGCCTGTTTG ACAACTTTGA ATGCCACGGG
PLP CtfOY INN 0C0 ELCN TVE CLF 0NFE CQC>
4510 4520 4530 4540 4550 4560 4570 . 4580 4590
? «??<<>>?
AACAGCAAGA CATGCAAGTA TGACAAATAC TGTGCAGACC ACTTCAAAGA ÜWCCACTGT AACCAGGGGT GCAACAGTGA GCAGTGTGGT
NSK TCKY DKY CAD HFKD NHC NOG CNSE ECG>
4600 4610 4620 4630 4640 4650 4660 4670 4680
$ * < t ? «-? » ?
ÎGGGATGGCC TGGACTCTGC TGCTGACCAA CCTGAGAACC TGGCAGAAGG TACCCTGGÎT ATTGTGGÏAT TGATGCCACC TGAACAACTG
WOC LDCA AOQ PEN LAEG TLV IVV LMPP E0l>
4690 4700 4710 4720 4730 4740 4750 4760 4770
? ????«???
CTCCAGGATC CTCCCAGCTT CTTCCGCGCA CTGGGTACCC TCCTCCACAC CAACCTCCGC ATTArCCGCC ACTCCCAGGG CGAACTCATG
100 ARSFLRA LGT LLHT NLR IKR OSQG ELM>
4780 4790 4800 4810 4820 4830 4840 4850 4860
? ? ? ? ? ? » « ?
GTCTACCCCT ATTATGGTGA GAAGTCAGCT CCTATCAAGA AACAGAGGAT GACACCCAGA TCCCTTCCTC GTGAACAACA ACAGGAGCTC
VYP YYCE K S A AMK KORM TRR SLP GEOE 0 E V>
FIG.17F
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
62
31-08-2001
nRAW EP01120663.8
Printed: 17-05-2004 o"J**?« ummvv PCT/Lc^v^m
.# 63/68
4870 4880 4890 4900 4910 4920 4930 494G 4950
? ??????t,
GCiCGCTCTA AAGTCTTTCT GGAAATTCAC MCCCCCAGT CTCTTCAAGA CTCACACCAC TGCTTCAAGA ACACCGATCC AGCAGCACCT
ACS KVFL EID NRO CVOO SOH CFK NTOA A A A>
4960 4970 4980 4990 5000 5010 5020 5030 5040
? i ? ? « ? ? « ,
CICCTGGCCT CracCCCAI ACAGGGCACC CTCTCAfACC CTCTTCTCTC TCTCGTCAGT GAATCCCTGA CTCCAGAACG CACTCACCIC
ILA S H A I QCT L S Y P L V S VVS E S L T P E R T 0 L>
5050 5060 5070 5080 5090 5100 5110 5120 5130
? ? « ?«? ? » « i
CTCTATCTCC TTCCTGTTGC TGTTCTCATC ATTCTGTTTA TTATTCTGCT CGCCCTAATC ATGGCAAAAC CAAAGCCTAA GCATGGCTCT
LYL LAVA VVI IlF (ILL GVI MAKRKRK H C S)
5140 5150 5160 5170 5180 5190 5200 521C 5220
«««??««?t
CTCTCGCTGC CTGAAGGTTT CACTCTTCCC CGAGATGCAA GCAATCACAA GCCTCGTGAG CCAGTGCGAC AGGATGCTGT GGGGCTGAAA
LtfL PEGF TLR RDA SNHK RRE PVG OOAV GLK>
5230 5240 5250 5260 5270 5280 5290 5300 5310
? ??????«?
AATCÎCÎCAC TGCAAGTCTC AGAACCTAAC CTAATTGGTA CTGGAACAAG TGAACACTGG GTCGATGATG AAGGGCCCCA GCCAAAGAAA
NLS VQVS EAN LIG TGTS NI VOO EGPO P K K>
5320 5330 5340 5350 5360 5370 5380 - 5390 5400
« ??«?????
CÎAAAGCCTG AAGATGAGGC CTTACTCTCA CAAGAAGATC ACCCCATTGA TKACCGCCA ÎGGACACAGC AGCACCTTGA ACCTGCAGAC
VKA EOEA LLS EEO OPID RRP HO Q H L E AA0>
5410 5420 5430 5440 5450 5460 5470 5480 5490
? ?««??»??
ATCOGTAGGA CACCATOGCT GGCTCTCACC CCTCCTCAGG ("ACACCAGCA CCTCGATGTG TTAGAÎGTGA AÎGTCCGTGG CCCAGATCGC
IRR TPSL ALT PPQ AEOE VOV LOV NVRG P0C>
5500 5510 5520 5530 5540 5550 5560 5570 5580
? »?????«?
TGCACCCCAT TGATGTTGGC TTCTCTCCGA GCAGGCAGCT CAGATTTGA2 TGATGAAGAT CAAGATCCAG AGGACTCTTC TGCTAACATC
CTP LMLA SLR GGS SOLS OED EOA EOSS ANI>
5590 5600 5610 5620 5630 5640 5650 5660 5670
* ? i ? « * ?'? ?
ATCACAGACT TGGTCTACCA GCCTGCCACC CTCCAGGCCC AGACACACCC CACTGGTGAG ATGGCCCTGC ACCTTGCAGC CCCCTACTCA
: " 0 LVYQ GAS LOA QTOR TGE MAL HLA A SM)
63
FIG. 17G
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
PH^:17«W004JT4TJ DRAW pcT/L EP0m0663.8
64/68
5680 5690 5700 57I0 5720 57J0 5740 5750 5760
III!« Ill,
CGGCCTCATG CTCCCAACCG TCTCCTGGAT GCACGTGCAG ATCCCAA'CC CCAGGACAAC ATGGGCCGCT GTCCACTCCA TCCTCCAGTC
RAD AAKR LLO AGA DA.VA QONMCR CPLH AAV>
5770 5780 5790 5800 5810 5820 5830 5840 5850
? i i » t ? a ? «
GCACCTGATG CCCAAGGIGT CTTCCAGATT CTCATTCGCA ACCGAGTAAC TGATCTAGAT GCCACGATGA ATCATGGTAC TACACCCCIG
AAO AOGV FOI LIR NRVT OLD ARM NDGT ï P i_>
5860 5870 5880 5890 5900 5910 5920 5930 5940
? i ? « ? ? ? ? .
ATCCTGGCTC CCCGCCTGGC TCTGGACGGA ATGGTGGCAG AACTGATCAA CTGCCAAGCG GATGTGAATG CAGTGGATGA CCATGGAAAA
IIA ARLA y i G MVA ELIN CQA DVN AVDD HGK>
5950 5960 5970 5980 5990 6000 6010 6020 6030
? » » « ? » » « «
TCTCCTCTTC ACTGGGCAGC TGCTGÎCAAT AATGTGGAGG CAACTCTTTI GTTGTTGAAA MTGGGGCCA ACCGAGACAÎ GCAGGACAAC
SAL HiYAA AVN NVE ATLL LLK NGA NROM Q0N>
6040 6050 6060 6070 6080 6090 6100 6110 6120
« ? ? ? « « « * »
AAGGAAGAGA CACCTCTGTT TCTTGCTGCC CGGGAGGGGA GCTAÎGAAGC AGCCAAGATC CÎGÎTAGACC ATTTTGCCAA TCGAGACATC
KEE TPLF LAA REG SYEA AKI LLO H FAN RDI>
5130 6140 6150 6160 6170 6180 6190 6200 6210
? ? « ? » « » » ?
ACAGACCATA TGGATCGTCT TCCCCCGGAT GTGGCTCGGG ATCCCATGCA CCATGACATT GTGCCCCTTC TGGATGAAÎA CAATGTGACC
TDH MDRL PRO VAR DRMH HOI VRL LOEY NVT>
6220 6230 6240 6250 6260 6270 6280 6290 6300
»?«»?««»«
CCAAGCCCTC CAGGCACCGT GTTGACTTCT CCTCTCTCAC CTGTCATCÎG TGGGCCCAAC AGATCTTTCC TCAGCCTGAA GCACACCCCA
PSP PGTV LTS ALS PVIC CPN RSF LSLK HÎP>
6310 6320 6340 6350 6360 6370 6380 6390 6400
? ????<<??
ATGGGCAAGA AGTCTAGACG CCCCAGTGCC AAGAGTACCA TGCCÎACÎAG CCTCCCTAAC CTTCCCAAGG AGGCAAAGGA TGCCAAGGGT
MGK KSRR PSA KST MPTS LPN LAK EAKD AKG>
6400 6410 6420 6430 6440 6450 6460 6470 6480
? ? ? ? » <«??
AGTAGGAGGA AGAAGTCTCT CAGTGACAAG GTCCAACTGT CTGAGAGTTC AGÎAACTTTA TCCCCTGTTG ATTCCCTAGA ATCTCCTCAC
S R R K K S L SEK V Q L S E S S V T L S P V D S L E S ? H>
FIG.17H
? SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
64
nRAW EP01120663.8
Printed: 17-05-2004 ou-j DHAW PCT,Lav.»/u9338
t
.? 65/68
6490 6500 6510 6520 6530 6540 6550 6560 657C
ACCTATCTTT CCCACACCAC AICCTCTCCA ATGATTACAT CCCCTCGGAT CTTACAGGCC TCACCCAACC CTATGTTGCC CACTGCCG
TYV SOFT SSP MIT SPCI LOA SPN PMLA " A A>

6580 6590 6600 6610 6620 6630 6540 6650 6660
? ????????
CCTCCTCCCC CACTCCATCC CCACCATGCA CTATCTTTTT CTAACCTTCA TCAAATGCAG CCTTTCGCAC ATGGGCCCAC CACTGTCCTT
PPA PVHA OHA LSF SNLH EMO PLA HCAS TVL>
6670 6680 6690 6700 6710 6720 6730 6740 6750
? ? i ? i « ? ? i
CCCTCAGTGA GCCAGTTGCT ATCCCACCAC CACATTGTCÏ CTCCAGGCAG TGCCAGTGCT GGAAGCTTGA GTAGGCTCCA TCCAGTCCCA
PSV SQLL SHH HIV SPGS GSA CSL SRLH PVP)
6760 6770 6780 6790 6800 6810 6820 6830 6840
? ?????<? ?
GTCCCACCAG ATTGGATGAA CCGCATCCAG GTGAATGAGA CCCAGTACAA TGAGATGTTT GGTAÎGGTCC ÎGGCTCCAGC TGACGCCACC
VPA OWMN RME VNE TQYN EMF CMV LAPA £CT>
6850 6860 6870 6880 6890 6900 6910 6920 6930
«<<???«??
CATCCTCGCA TAGCTCCCCA GAGC^GGCCA CCTGAAGGGA AGCACATAAC CACCCCTCGG GAGCCCTTGC CCCCCATTGT GACTTTCCAC
HPG IAP0 SRP PEG KHIT TPR EPL PPIV T F O
6940 6950 6960 6970 6980 6990 7000 * 7010 702C
TI>rN>»l>"
CTCATCCCTA AAGGCAGTAT TGCCCAACCA GCGGGGGCTC CCCACCCÎCA GTCCACCÎCC CCTCCAGCTG TTGCGOXCC CCT
LIP KCSI AOP AGA PQPO STC PPA VAGP L3'>
7030 7040 7050 7060 7070 7080 7090 7100 71 iC
«?«??**??
ATGTACCAGA TTCCAGAAAT GGCCCGTTTG CCCAGÎGTGG CÎTTCCCCAC TGCCATGATG CCCCACCAGG ACCGGCAGGT ACCTCAGACC
MYQ IPEM ARL PSV AFPT AMM POQ OC OV AQ*>
7120 7130 7140 7150 7160 7170 7180 7190 7200
? ?«?«««* ?
ATTCTCCCAC CCTATCATCC TTTCCCAGCC TCTGTGGGCA AGTACCCCAC ACCCCCTTCA CAGCACAGTT ATGCTTCCTC AAATCCTCC*
IIP AYHP FPA SVG KYPT PPS QHS YASS NAA>
7210 7220 7230 7240 7250 7260 7270 7280 729!
CAGCGAACAC CCAGTCACAG TCGTCACCTC CAGGGTGAGC ATCCCTACCT GACACCATCC CCAGAGTCTC CTCACCAGTG GTCAACTTCA
ER: PSHS CHL OCE H P Y L TPS PES POOW SSÎ

fifi
FIG. 171
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
Pnnted:17-05-2004 DRAW EP01120663.8
.»v/7.4/07474 PCT/LS93/09338
'* 66/68
7300 73I0 7320 7330 7340 7350 7360 7370 7J8C
? ??????i,
iCACCCCACT CTGCTTCTCA CTCCTCACAT CTCACCACCA CCCCTACCCC TCGGGGTCCT GGACGAGCTC ACCGGCGACC TCGGACACAC
SPH SASD WSO VIT S P T P CCA CCC ORG0 CrH>
7390 7400 7410 7420 7430 7440 7450 7460 7470
? ? ? « ? » « i »
ATCTCTCAGC WCCACACAA CAACATCCAC CTTTATGCGT GAGACACTCC ACCTCCAGTG TAGACACATA ACTGACTTTT CIAAATCCTG
MSE P P H N NMO VYA>
7480 7490 7500 7510 7520 7530 7540 7550 7560
? ? « « i ? » i i
CTGACCAACA AAÎGAAGGTC ATCCCGGACA GAAATGAAGA AATCTCTGGA CCCAGCTTCT AGAGGTAGGA AAGAGAAGAT CTTCTTATTC
7570 7580 7590 7600 7610 7620 7630 7640 7650
? i ?>???? i
AGATAATGCA AGAGAAGCAA TTCGTCAGTT TCACTGGGTA TCTGCAAGGC TTATTGATTA TTCÎAATCTA ATAAGACAAG TTTGTCGAAA
7660 7670 7680 7690 7700 7710 7720 7730 7740
? t « ? ? i < ? >
TGCAAGATGA ATACAAGCCT TGGGTCCATC TTTACTCTCT TCTATTTGGA GAATAAGATC GATGCTTATT CAACCCCAGA CAÎTCTTGCA
7750 7760 7770 7780 7790 7800 7810 7820 7830
? ? » ? » * » ? ?
GCTTGGACTG CATTTTAACC CCTGCAGGCT TCTCCCATAT CCATGAGAAG ATTCTACACT AGCCTCCTGT TGGGAAÎTAT GCCCTGGAAT
7840 7850 7860 7870 7880 7890 7900 7910 7920
? ? » « ? ? « ?'?
TCTGCCTGAA TTCACCTACC CATCTCCTCC TCCTTGGACA TTCTÎTTGTC TTCATTTCGT GCTTTTGGTT TTGCACCTCT CCCTGA'iC'
7930 7940 7950 7960 7970 7980 - 7990 8000 8010
? ??îti
AGCCCTACCA GCATGTTATA OX*GAAGACC TTTGTGCTTT TGATCATTCÎ (ECCCATGAA AGCAACTTTG GTCTCCTTTC CCCTCCTGTC
8020 8030 8040 8050 8060 8070 8080 8090 8100
? ? « « * i * ? ?
TÎCCCGGTAT CCCTTGCAGT CTCACAAGGT TTACTTTGGT AÎGGTTCTCA GCACAAACCT TTCAAGTATG TÏGTTÎCTTI GCAAAATGCA
8110 8120 8130 8140 8150 8160 8170 8180 8190
«??««????
CATACTGTAT TGTCTTCTCC TGCATATATC ATTCCTGGAG AGACAAGGGG ACAACAATAC TTTTCTTCAA CAAATTTTGG GGGCAGGAGA
8200 8210 8220 8230 . 8240 8250 8260 8270 3280
? ???*????
TCCCîTCAAG ACCCTCCACC TTAATTTTTC TTCTCTGTGT GCAGGTCTTC ATATAAACTT TACCAGGAAG AAGGGÎGTGA GTTTCTTCTT
FIG. 17 J
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
66
Printed:17-05-2004 074-4 DRAW pcr/L E P01120663.8
.9 67/68
8290 8300 8310 832C 8330 8340 8350 8J6C 337C
TTTCTCTCTA TCCCCCTCCI CAGTCfAAAG TTTTATCCTT GATAGTCTAG TTACTATGAC CCTCCCCACI TTTTTAAAAC CAGAAAAAGC
8380 8390 8400 8410 8420 8430 8440 845C 8460
? «???????
TTTGCAATCf ÎGGAATGACC AAGAGACAAG TTAACTCCTG CAAGAGCCAG TTACCCACCC ACAGCTCCCC CTACTTCCTG CCAAGCATTC
8470 8480 8490 8500 8510 8520 8530 8540 8550
? « ? i ? < ? i i
CATTGACTGC CTCTATGGAA CACATTTGTC CCAGATCTGA CCATTCTAGG CCTGTTTCAC TCACTCACCC AGCATATGAA ACTAGTCTTA
8560 8570 8580 8590 8600 8610 8620 8630 8640
? » » I ? « I ! ,
ACTGTTGAGC CTTTCCTTTC ATATCCACAC AAGACACTGT CTCAAAÎGTT GTACCCTTGC CATTTAGGAC TGAACTTTCC TTAGCCCAAC
8650 8660 8670 8680 8690 8700 8710 8720 8730
t ?«?????!
GGACCCAGTC ACAGTTGTCT TCCCTTTGTC AGATGATCAG TCTCTACTGA TTATCTTGCT CCTTAAAGGC CTCCTCACCA ATCTTTCTTT
8740 8750 8760 8770 8780 8790 8800 8810 8820
? ??«»«»??
OCACCCTCT GCTCCGTGTT ACTGGTATAC CCAGTATGTT CTCACTGAAG ACATGGACTT TATATGTTCA AGTCCAGGAA TTGGAAAGTT
8830 8840 8850 8860 8870 8880 8890 . 8900 8910
? * ? * ? ? ? . ? ?
CCACTICTTT TCTATGATCC AAAACAGCCC TATAAGAAGG TTGGAAAAGG AGCAACTATA TAGCAGCCTT TGCTATTTTC TGCTACCATT
8920 8930 8940 8950 8960 8970 8980 8990 9000
? ? ? ? ? « ? ? «
TCTTTÎCCTC TGAAGCGGCC AÎGACATTCC CTTTGGCAAC TAACGTAGAA ACÏCAACAGA ACATTTICCT TTCCTAGAGT CACCTTTTAG
9010 9020 9030 9040 9050 S060 9070 9080 9090
? » ? ? » « » ? «
ATCATAATCC ACAACTATAG ACTTGCTCAT TGTTCAGACT CATTCCCCCT CACCTGAAÏC CACTCTCTGT ATTCATGCTC TTGGCAATTT
9100 9110 9120 9130 9140 9150 9160 9170 9180
? ? * ? » * » ? ?
CTTTCACTTT CTTTTAAGGG CAGAAGCATT TTAGTTAATT GTAGATAAAG AATAGTTTTC ÎTCCTCTTCT ?TTGGCCCA CTTAATAATT
9190 9200 9210 9220 9230 9240 9250 9260 9270
? »»??»?««
CCTCCATCCC TACACTCCAA CTTCCGTCCA GTGCTGTGAT GCCCATGACA CCTGCAAAAT AACÎTCTGCC TGGCCATTTÎ CTAGATATTA
FIG. 17K
67
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)
' 31-08-2001
nRAW EP01120663.8
Printed: 17-05-2004 0T4-4 UMMVV PCT/Lbyj/ü9338
i
? 68/68
9280 9290 9300 93I0 9320 9330 9340 9350 9360
« ? i i i i i i ,
ACAGGTGAAF TCCCCACTCT TTTGCTTTGA ATGACAGTTC TCATTCCTTC TATGGCTGCA AGTATGCATC AGTCCTTCCC ACTTACCTGA
9370 9380 9390 9400 9410 9420 9430 9440 9450
? # « i ? ? » ? i
TTTCTCTGIC GGTCGCCCCA TATGCAAACC CTGCCTCTCT CTTGCCATAA TACTTTACAA ATGGTTTTTT CAGTCCTATC CAAATTTATT
9460 9470 9480 9490 9500 9510 9520 9530 9540
? ? ? « ? ? ? i ?
GAACCAACAA AAATAATTAC TTCTGCCCTG AGATAAGCAG ATTAAGTTTG TTCATTCTCT GCTTTATTCT CTCCATGTGG CAACATTCTG
9550 9560 9570 9580 9590 9600 9610 9620 9630
? » «»«??»?
TCACCCTCTT TCATACTGTG CAAACATTTT ATCATTCTAA ATGCTGACTC TCTGCCCTTG GACCCATTIA TTATTCACAG ATGGGGAGAA
9640 9650 9660 9670 9680 9690 9700 9710 9720
CCTATCTGCA TGGACCCTCA CCATCCTCTG TGCAGCACAC ACAGTGCACC GAGCCAGTGG CGATGCCGAT GACTTTCTTC CCC.TGGGAAT
TCC
FIG.17L
SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 31-08-2001
68